本文選題：鼻咽癌 + GnT-V�。� 參考：《南方醫(yī)科大學》2011年碩士論文

【摘要】：一、研究背景 生物體內的蛋白質絕大多數(shù)都是以糖蛋白的形式存在。位于高爾基體內的N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶在糖蛋白的合成中起關鍵作用。N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶至少有6種,其中N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶-V(N-acetylglucosaminyltransferase V, GnT-V)是目前研究最多的。其主要功能是在核心五糖基礎上形成多分支結構,將供體底物UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)中的GlcNAc (Gn)糖基轉移至N-聚糖五糖核心的兩個甘露糖上,催化N-糖鏈的β1,6分支的形成。GnT-V影響腫瘤惡性生物學行為的機制有兩種：一是做為糖基轉移酶,其異常表達可引起細胞糖蛋白β1,6分支結構的異常糖基化,從而影響著腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲能力。二是作為高爾基體酶,可分泌到血液循環(huán)中,這種分泌形式的GnT-V可引起腫瘤血管的生成。目前的研究表明在結腸癌和乳腺癌中,GnT-V的表達量和腫瘤的惡性生物學行為呈正相關；然而在非小細胞肺癌中,GnT-V的表達量越低,腫瘤的惡性程度反而越高。以上的研究表明在不同的腫瘤細胞中,GnT-V扮演著不同的角色。 鼻咽癌在我國南方地區(qū)的發(fā)病率極高,嚴重影響了我國南方地區(qū)人民的生活質量。影響鼻咽癌惡性生物學行為的因素很多,包括EB病毒的感染,某些分子結構的改變,例如：Bmi-1蛋白,基質金屬蛋白酶-19等。約30%-40%的進展期鼻咽癌病人會發(fā)生局部復發(fā)和遠處轉移。鼻咽癌分為WHOⅠ,Ⅱ和Ⅲ型,其中97%的病例屬于WHOⅢ型,放射治療是Ⅲ型鼻咽癌的主要治療方式。但是由于個體差異,并不是所有鼻咽癌細胞都對放射治療敏感,有些鼻咽癌細胞放射敏感性低,治療效果差。已經發(fā)現(xiàn)的和鼻咽癌細胞放射敏感性有關的預測分子有Raf激酶抑制蛋白,GRP78蛋白和p53基因等。但是目前為止尚未有一個公認的標志性分子能預測鼻咽癌細胞的放射敏感性。 雖然很多研究表明GnT-V和多種腫瘤的惡性生物學行為密切相關,但是目前尚未有報導鼻咽癌細胞和GnT-V之間關系的研究。在本實驗中,我們利用RNA干擾技術,下調鼻咽癌細胞CNE-2中GnT-V的表達量,得到了低表達GnT-V的細胞株CNE-2 GnT-V/2224;通過對比鼻咽癌細胞和低表達GnT-V的鼻咽癌細胞的惡性生物學行為,研究GnT-V和鼻咽癌細胞增殖、侵襲等生物學特征的關系。另外,我們還研究了GnT-V對鼻咽癌細胞放射敏感性的影響,并對其可能內在機制進行了討論。 二、研究目的 利用RNA干擾技術,下調鼻咽癌細胞CNE-2中GnT-V的表達量,觀察GnT-V對鼻咽癌細胞增殖、侵襲、轉移、放射敏感性的影響,為鼻咽癌分子靶向治療研究中新靶標的確定提供客觀依據(jù)。 三、實驗方法 1、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA質粒的構建及鑒定已由本課題組成員完成。pGPU6/GFP/Neo GnT-V/1564和pGPU6/GFP/Neo GnT-V/2224為靶向抑制GnT-V表達的質粒；pGPU6/GFP/Neo GnT-V/NC為對照質粒。 2、細胞培養(yǎng)和轉染 人鼻咽癌細胞株CNE-2在37℃5%C02條件下,培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI-1640中,每周傳代2-3次。細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用脂質體Lipofectamine2000TM將質粒導入CNE-2細胞。利用G418篩選轉染成功的細胞。 3、pGPU6/GFP/Neo GnT-V shRNA干擾效果檢測 a.qRT-PCR測定GnT-V mRNA 用Trizol提取對數(shù)生長期細胞中總RNA,按實時熒光定量RT-PCR試劑盒說明進行實驗。GnT-Ⅴ上游引物為5'GAGCAGATCCTGGACCTCAG 3',下游引物為5'GCTGTCATGACTCCAGCGTA 3'。β-actin作為內參,上游引物為5'GAAACTACCTTCAACTCCATC 3'下游引物為5'CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC 3'。合成cDNA的反應條件為：15分鐘37℃,5秒85℃。PCR的反應條件為：預變性95℃30秒,PCR反應95℃5s,60℃20s(40個循環(huán)),溶解曲線分析95℃0秒,65℃15秒,95℃0秒。計算出2-ΔΔCt,代表每組mRNA的相對表達量。每組重復例數(shù)為3。 b.Western blot檢測GnT-Ⅴ蛋白表達 提取總蛋白,測定蛋白濃度,吸取總蛋白,去離子水補至20μL,加入上樣buffer煮沸5min,離心后吸取25μL上樣,經不連續(xù)SDS-PAGE電泳分離后,用半干法電轉移至PVDF膜上,7%脫脂奶粉+3%的BSA在37℃封閉2h, TBST洗膜后用羊抗人GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗體(1：200)、羊抗人GAPDH蛋白單克隆抗體(1：1000)4℃孵育過夜,洗膜后分別加入HRP標記的兔抗羊IgG(1:4000),IgG(1: 6000),室溫下?lián)u動1h,洗膜后用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)檢測,暗室曝光x線片,沖洗膠片,UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像,Quantity One軟件分析條帶灰度值,用GnT-Ⅴ/GAPDH代表GnT-Ⅴ蛋白的相對表達量。每組重復例數(shù)為3。 4、CCK-8檢測下調GnT-Ⅴ表達后對CNE-2細胞增殖能力的影響 取對數(shù)生長期的待測細胞,CCK-8法測量不同時間點的OD450nm值(0h、24h、48h、72h、96h)。計算出細胞生長分數(shù),繪制生長曲線。實驗分為CNE-2組,CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組,CNE-2 GnT-Ⅴ/2224組,每組重復例數(shù)為12。 5、劃痕愈合實驗檢測下調GnT-Ⅴ表達后對CNE-2細胞遷移能力的影響 取對數(shù)生長期的待測細胞,接種于24孔板,培養(yǎng)至細胞呈單層貼壁生長狀態(tài)。用100ul的槍頭分別在各組單細胞層上劃痕,用含10% FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以使劃痕愈合。分別于劃痕后0h、12h、24h拍照,觀察劃痕愈合能力,用愈合率代表愈合能力。愈合率=[(愈合前兩側細胞層距離-愈合后兩側細胞層距離)/愈合前兩側細胞層距離]×100%。實驗分為CNE-2組, CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組和CNE-2 GnT-Ⅴ/2224組,每組重復例數(shù)為3。 6、細胞侵襲實驗檢測下調GnT-Ⅴ表達后對CNE-2細胞侵襲能力的影響 取對數(shù)生長期的細胞,用無血清RPMI1640培養(yǎng)過夜。通過24孔趨化小室和matrigel膠檢測細胞侵襲性。結果表示為同時穿過matrigel膠和聚碳酸酯膜的細胞數(shù),顯微鏡下隨機取5個視野計數(shù)。實驗分為CNE-2組,CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組和CNE-2 GnT-Ⅴ/2224組,每組重復例數(shù)為15。 7、異質粘附實驗檢測下調GnT-Ⅴ表達后對CNE-2細胞異質粘附能力的影響 以Matrigel膠模仿基底膜進行異質粘附實驗,Matrigel膠4℃過夜融化,取96孔板,Matrigel膠50μL/孔鋪板,輕輕搖晃鋪平Marigel膠,37℃1Omin凝固。10g/L BSA (1×PBS配制)煮沸13min變性后,每孔加100μL,37℃封閉1h,封閉結束后用1×PBS沖洗2次。待測細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用無血清RPMI1640培養(yǎng)過夜。收集細胞,調整細胞數(shù)為5×104/孔,加入細胞懸液,5%CO2 37℃孵育1h。取出96孔板,1×PBS沖洗,每孔加入100μL RPMI1640和10μLCCK-8,37℃、5%CO2培養(yǎng)1h,測量兩組OD450nm值。96孔板直接鋪10g/L BSA,不鋪Matrigel膠為對照組。粘附率=(實驗組OD450nm/對照組OD450nm-1)%。實驗分為CNE-2組,CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組和CNE-2 GnT-Ⅴ/2224組,實驗重復例數(shù)為16。 8、平板克隆形成實驗觀察下調GnT-Ⅴ表達后對CNE-2細胞放射敏感性的影響 取對數(shù)生長期的待測細胞倍比稀釋,每個六孔板接種200個細胞,24小時細胞貼壁后接受X線照射(0,2,4,6,8Gy)。2周后計算形成的克隆數(shù),通過克隆數(shù)計算出細胞生存分數(shù)。實驗分為CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組和CNE-2 GnT-Ⅴ/2224組,每組重復例數(shù)為16。 9、平行板流動腔檢測下調GnT-Ⅴ表達后對CNE-2與血管內皮細胞粘附能力的影響 流動腔的下表面為35mm的培養(yǎng)皿,上表面為聚甲基丙烯酸甲酯制成的平板,上下表面之間用0.2mm的硅膠墊隔開,形成一個20mm×2.5mm×0.2mm的腔。流動腔還有一個進口和出口,進口連接的是裝著細胞的離心管,出口連接著一個輸液器泵,能維持穩(wěn)定的流體剪切力。待測血管內皮細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用0.25%胰酶消化細胞,離心,重懸,接種于直徑為35mm的培養(yǎng)皿。待細胞鋪滿80%-90%進行實驗。用2%的BSA封閉血管內皮細胞4小時,取對數(shù)生長期的CNE-2 GnT-V/NC細胞和CNE-2 GnT-V/2224細胞,消化、重懸,調整細胞的濃度為106/ml。在0.25 dyn/cm2的流體剪切力下,腫瘤細胞通過流動腔。5分鐘后記錄實驗結果。隨機挑選5個視野,計算和血管內皮細胞粘附的腫瘤細胞的數(shù)量。每組重復例數(shù)為15。 9、檢測沉默GnT-V表達后對CNE-2凋亡和周期的影響 細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后,常規(guī)胰酶消化,收集細胞。進行石蠟包埋。按試劑盒說明進行TUNEL實驗,檢測細胞的凋亡。呈棕色的為凋亡細胞,隨機挑選5個視野計算細胞凋亡率。每組重復例數(shù)為3。 細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后,常規(guī)胰酶消化,用PBS洗滌細胞2次,收集105細胞。在50μL的Binding Buffer中加入5μL 7-AAD染液,混勻。收集細胞中加入上述7-AAD染液,混勻；室溫、避光、反應5～15min。反應后再加入450μL的Binding Buffer混勻。加入1μLAnnexin V-PE混勻；室溫、避光、反應10min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡。每組重復例數(shù)為3。 細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后,常規(guī)胰酶消化,PBS洗3次,制成單細胞懸液,并調整細胞濃度至106/ml。加入3ml預冷PBS重懸細胞,800rpm×5min,吸凈上清。.加入500ul PBS,輕輕重懸細胞,使細胞分離為單個,加入預冷的75%乙醇(-20℃)。.取出固定的樣品,800 rpm×5min,棄上清。加入3 ml預冷PBS重懸細胞和PI工作液,4℃避光染色30分鐘。轉至流式檢測管,上機檢測細胞周期。每組重復例數(shù)為3。 10、統(tǒng)計學分析 實驗結果均經SPSS13.0軟件統(tǒng)計。qRT-PCR、Western-Blot.侵襲實驗、異質粘附實驗結果多組比較采用完全隨機設計的方差分析,多重比較采用LSD法。平行板流動腔實驗、細胞周期和凋亡實驗采用兩獨立樣本t檢驗,參數(shù)比較均先進行方差齊性檢驗,若方差不齊,用基于方差不齊的近似F檢驗(Welch法)。細胞增殖實驗、細胞劃痕實驗、平板克隆實驗采用析因設計的方差分析。由于方差不齊,所以細胞增殖實驗每組細胞內5個時間點的多重比較采用Dunnett'sT3法；由于方差齊性,所以細胞劃痕實驗每組細胞內3個時間點的多重比較和平板克隆形成實驗每組細胞內多個劑量的多重比較均采用LSD法。P0.05代表有統(tǒng)計學差異。 四、結果 1、重組質粒的穩(wěn)定轉染 質粒pGPU6/GFP/Neo中含有編碼GFP的基因,故轉染細胞在熒光顯微鏡下可激發(fā)出綠色熒光。在熒光顯微鏡下觀察,細胞均發(fā)熒光,說明穩(wěn)定轉染成功。 2、干擾效果分析 通過qRT-PCR實驗檢測CNE-2,CNE-2 GnT-V/NC,CNE-2 GnT-V/1564和CNE-2 GnT-V/2224四組細胞株中GnT-VmRNA的表達量。CNE-2 GnT-V/1564的2-ΔΔCt值為(0.43±0.06),CNE-2 GnT-V/2224的2-ΔΔCt值為(0.33±0.03),表明CNE-2 GnT-V/2224中GnT-V mRNA的表達量較CNE-2GnT-V/1564少。Western blot結果也顯示CNE-2 GnT-V/2224中蛋白的表達量較CNE-2 GnT-V／1564少。選擇干擾效率較高的CNE-2 GnT-V/2224進行下一步實驗。CNE-2 GnT-V/NC中GnT-VmRNA和蛋白的差異均無統(tǒng)計學意義。 3.GnT-V shRNA對細胞增殖的影響 通過Cck-8法檢測CNE-2,CNE-2 GnT-V/NC和CNE-2 GnT-V/2224三組細胞的增殖能力。以細胞在不同時間點(0h、24h、48h、72h、96h)的生長分數(shù)值繪制細胞生長曲線,并計算出CNE-2 GnT-V/2224的生長分數(shù)�？梢奀NE-2 GnT-V/2224的生長分數(shù)較CNE-2 GnT-V/NC低(P0.001)。說明下調GnT-V的表達后,細胞的增殖能力明顯降低。 4.GnT-V shRNA對細胞遷移能力的影響 下調GnT-V的表達延長了細胞劃痕愈合時間,說明下調GnT-V的表達后抑制了細胞的遷移能力。 5.GnT-V shRNA對細胞侵襲能力的影響 CNE-2 GnT-V/2224組和CNE-2GnT-V/NC組穿過Matrigel膠和聚碳酸酯膜的細胞數(shù)分別為(58.20±8.53)個和(127.47±9.22)個(t=21.361,P0.001)。實驗結果顯示,下調GnT-V表達可以抑制CNE-2細胞的侵襲能力。 6.GnT-V shRNA對CNE-2細胞異質粘附能力的影響 CNE-2 GnT-V/2224組和CNE-2GnT-V/NC組的粘附率分別為(35.70±28.27)%和(70.10±14.82)%,說明下調GnT-V表達,可抑制CNE-2細胞的異質粘附能力。 7.GnT-V shRNA對CNE-2與血管內皮細胞粘附能力的影響 粘附于血管內皮細胞的CNE-2 GnT-V/NC和CNE-2GnT-V/2224的細胞數(shù)分別為(240.80±29.50)和(57.60±12.85),兩者間有統(tǒng)計學差異。表明下調GnT-V的表達抑制鼻咽癌細胞對血管內皮細胞的粘附能力。 8.GnT-V shRNA對CNE-2放射敏感性的影響 CNE-2 GnT-V/2224組的生存分數(shù)較CNE-2GnT-V/NC組低,且放射增敏比為1.37,說明下調GnT-V的表達后細胞的放射敏感性增高。 9.GnT-V shRNA對CNE-2細胞周期和凋亡的影響 利用TUNEL實驗計算出CNE-2 GnT-V/2224和CNE-2 GnT-V/NC的細胞凋亡率分別為(35.31±2.61)%和(18.97±1.64)%。通過流式細胞儀得出CNE-2 GnT-V/2224和CNE-2 GnT-V/NC的細胞凋亡率分別為(26.11±2.43)%和(10.80±1.90)％.CNE-2 GnT-V/2224和CNE-2 GnT-V/NC S期比例的細胞分別為(28.40±0.27)%和(41.60±1.74)％。CNE-2 GnT-V/2224和CNE-2 GnT-V/NC G1期比例分別為(59.93±2.38)%和(43.43±2.90)%。下調GnT-V的表達后細胞的凋亡率增加,細胞周期從G1期到S期發(fā)生阻滯。 10.Western blot的實驗結果表明CNE-2 GnT-V/2224中bcl-2蛋白的表達量較CNE-2 GnT-V/NC降低(53.00±3.61)%。且CNE-2 GnT-V/2224和CNE-2 GnT-V/NC兩組細胞經照射后再次檢測bcl-2蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)：經過照射后CNE-2 GnT-V/2224中bcl-2蛋白的表達量較放射前降低了(25.33±9.07)%,而CNE-2 GnT-V/NC組中bcl-2蛋白相對于GAPDH的光密度值在放射前后分別為(80.67±2.52)%和(75.67±6.03)%,但差異無統(tǒng)計學意義(t=1.326,P=0.256)。 CNE-2 GnT-V/2224和CNE-2 GnT-V/NC兩組細胞中E鈣粘蛋白表達量的差異無統(tǒng)計學意義。說明下調GnT-V的表達對E鈣粘蛋白的表達量無影響。 五、結論 1、靶向GnT-V的shRNA真核表達質�？梢韵抡{GnT-V的mRNA和蛋白表達。 2、下調GnT-V表達后,CNE-2細胞的體外增殖、遷移、侵襲能力受到抑制,細胞凋亡率增加,細胞周期發(fā)生阻滯。 3、下調GnT-V表達后細胞的放射敏感性增高,可能與bcl-2蛋白的改變有關。 4、下調GnT-V表達對E鈣粘蛋白的表達量無影響。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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1 賀富麗;馬強;張健;;靶向糖基轉移酶shRNA表達質粒對LoVo細胞侵襲和增殖能力的抑制作用[J];生物化學與生物物理進展;2009年08期

2 王濤,張俊紅,周云峰;放療加誘導化療治療晚期鼻咽癌的臨床觀察[J];腫瘤防治研究;2001年02期

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本文編號：2000502