發(fā)布時(shí)間：2018-05-24 22:09

  本文選題：高糖 + 人晶狀體上皮細(xì)胞�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 目的:糖尿病性白內(nèi)障(Diabetic cataract)是糖尿病患者失明的主要因素之一。臨床觀察表明,糖尿病患者的老年性白內(nèi)障發(fā)病率更高,發(fā)病年齡較非糖尿病者更為提前,而且成熟更為迅速,即糖尿病因素可以使白內(nèi)障提早出現(xiàn)或加速其發(fā)展。然而,目前糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近年來(lái)一系列基礎(chǔ)和臨床研究顯示,糖尿病情況下存在著明顯的氧化應(yīng)激,氧化應(yīng)激是晶狀體上皮細(xì)胞損傷的重要因素。 本實(shí)驗(yàn)小組前期研究結(jié)果顯示,糖尿病時(shí),大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS) mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào),iNOS活性顯著增高,其合成的一氧化氮(nitric oxide,NO)大量增加。過(guò)量產(chǎn)生的NO與超氧陰離子(superoxide, O2-)快速反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝基陰離子(peroxynitrite, ONOO-)。ONOO-可有效硝基化蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基,形成3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine, 3-NT)。3-NT被公認(rèn)為ONOO-形成的特異性標(biāo)志。蛋白質(zhì)被ONOO-硝基化后,它們的結(jié)構(gòu)和功能就會(huì)受到影響,增強(qiáng)或抑制則取決于不同的蛋白質(zhì)。 本實(shí)驗(yàn)小組前期試驗(yàn)證明,糖尿病中,ONOO-可引起iNOS和環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)的蛋白質(zhì)硝基化,加重對(duì)糖尿病血管的損傷。已知NF-кB是iNOS的上游調(diào)控因子,目前發(fā)現(xiàn)NF-кB家族存在5種蛋白,包括p65(Rel-A),c-Rel,Rel-B, p50(其前體蛋白為p105)和p52(其前體蛋白為p100)。NF-кB蛋白家族通常以同源或異源二聚體形式存在,其中p50-p65二聚體是最廣泛的存在形式。當(dāng)細(xì)胞處于未受刺激時(shí),p50-p65二聚體與NF-кB抑制蛋白(Inhibitory kappa B protein,IкB)以三聚體的形式結(jié)合在一起,使NF-кB處于一種無(wú)活性狀態(tài),滯留于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到高糖刺激時(shí),IкB激酶復(fù)合物(I-kappa B kinase complex,IKK)被激活,IкB的N-端被磷酸化,于是NF-кB得以被激活,移位進(jìn)入細(xì)胞核,與DNA鏈上的特異кB序列結(jié)合,從而發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的活性。那么,在高糖狀態(tài)下,晶狀體上皮細(xì)胞中NF-кB的核轉(zhuǎn)位、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平如何?關(guān)于這方面的研究尚未見報(bào)道。 3-嗎啉-斯德酮亞胺(3-morpholinosydnonimine,SIN-1)是ONOO-的特異供體。 四磺基苯基鐵卟啉(5,10,15,20-Tetrakis-(4-sulfonatophenyl)porphyrinato-iron(III),FeTPPS)是ONOO-的分解催化劑。 本實(shí)驗(yàn)采用人晶狀體上皮細(xì)胞株SRA01/04,應(yīng)用高糖模擬糖尿病高糖狀態(tài)模型,從細(xì)胞水平,應(yīng)用不同濃度的葡萄糖、ONOO-的供體SIN-1、ONOO-的分解催化劑FeTPPS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中,以NF-кBp65亞基為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)定NF-кB的核轉(zhuǎn)位、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平,從而為進(jìn)一步研究硝基化對(duì)NF-кB與DNA結(jié)合活性及對(duì)NF-кB靶基因(如iNOS和COX-2)活性的影響奠定基礎(chǔ)。 方法: 1細(xì)胞培養(yǎng) 配置低糖DMEM培養(yǎng)基和0.25%的胰蛋白酶消化液,用含10%新生牛血清和1%非必需氨基酸的低糖DMEM培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和傳代。 2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組 2.1探討高糖(25mmol/L)對(duì)SRA01/04細(xì)胞中NF-кBp65核轉(zhuǎn)位和核內(nèi)蛋白含量的影響。用25mmol/L的高糖培養(yǎng)液孵育SRA01/04細(xì)胞,按照不同作用時(shí)間分為9組:0、5、10、15、20、25、30、35、40min組。 2.2探討不同濃度葡萄糖對(duì)SRA01/04細(xì)胞中NF-кBp65核轉(zhuǎn)位、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平的影響。實(shí)驗(yàn)分為5組:5.5、10、15、20、25、30mmol/L組。作用時(shí)間為20min。 2.3探討ONOO-對(duì)SRA01/04細(xì)胞中NF-кBp65核轉(zhuǎn)位、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平的影響。用SIN-1作為ONOO-供體,按照不同濃度分為6組:0、10、50、100、250、500μmol/L組。作用時(shí)間為20min。 2.4探討高糖(25mmol/L)狀態(tài)下,清除ONOO-后對(duì)SRA01/04細(xì)胞中NF-кBp65核轉(zhuǎn)位、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平的影響。用25mmol/L的高糖培養(yǎng)基孵育SRA01/04細(xì)胞,用FeTPPS作為ONOO-的分解催化劑,按照FeTPPS的不同濃度分為6組:0、5、10、25、50、100μmol/L組。作用時(shí)間為20min。 3 NF-кBp65核轉(zhuǎn)位的形態(tài)學(xué)觀察。 免疫熒光染色法觀察SRA01/04細(xì)胞中NF-кBp65亞基是否轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)從而確認(rèn)NF-кB是否被活化。 4細(xì)胞核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量及其硝基化水平的檢測(cè)。 提取各組核蛋白后,Lowry法進(jìn)行核蛋白定量,Western blotting檢測(cè)各組細(xì)胞核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量及其硝基化水平,即NT含量。 結(jié)果: 1高糖(25mmol/L)對(duì)SRA01/04細(xì)胞中NF-кBp65核轉(zhuǎn)位和核內(nèi)蛋白含量的影響。 免疫熒光顯示,正常組(0min)NF-кBp65主要分布在細(xì)胞漿內(nèi),細(xì)胞核內(nèi)未見或很少(NF-кBp65在胞漿中為失活狀態(tài),在核中為活化狀態(tài))。高糖(25mmol/L)與SRA01/04細(xì)胞孵育不同時(shí)間后,高糖呈時(shí)間依賴性增加細(xì)胞中NF-кBp65核轉(zhuǎn)位,其中以20min作用最為明顯。 Western blotting結(jié)果顯示,5min時(shí)核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(2.38±0.39)、10min時(shí)核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(2.23±0.45)、15min時(shí)核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(2.33±0.41)、20min時(shí)核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(2.99±0.62)、25min時(shí)核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(2.37±0.35)較正常對(duì)照組核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(1.50±0.32)顯著增加(P0.05)。其中,以20min時(shí)核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量增加最為明顯(P0.05)。內(nèi)參組蛋白(Histone)表達(dá)基本一致。(見Fig.1和Fig.2) 2不同濃度葡萄糖對(duì)SRA01/04細(xì)胞中NF-кBp65核轉(zhuǎn)位、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平的影響。 免疫熒光顯示,正常組(5.5mmol/L) NF-кBp65主要分布在細(xì)胞漿內(nèi),細(xì)胞核內(nèi)未見或很少。不同濃度葡萄糖與SRA01/04細(xì)胞共孵育20min后,呈濃度依賴性增加NF-кBp65核轉(zhuǎn)位。其中以20mmol/L葡萄糖組和25mmol/L葡萄糖組作用較為明顯。 Western blotting結(jié)果顯示,10mmol/L葡萄糖組的核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(2.29±0.29)及其硝基化水平(3.18±0.46)和15mmol/L葡萄糖組的核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(2.42±0.36)及其硝基化水平(3.27±0.47)較正常組核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(1.67±0.31)及其硝基化水平(2.02±0.48)增加較為明顯(P0.05),兩組間無(wú)明顯差異。20mmol/L葡萄糖組的核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(2.50±0.41)及其硝基化水平(4.62±0.62)和25mmol/L葡萄糖組的核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(2.69±0.37)及其硝基化水平(4.17±0.57)較其他組核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量增加最為明顯(P0.05),兩組間無(wú)明顯差異。提示20mmol/L和25mmol/L葡萄糖對(duì)NF-кBp65的核內(nèi)蛋白含量和硝基化水平影響最明顯。內(nèi)參Histone表達(dá)基本一致。(見Fig.3和Fig.4) 3不同濃度SIN-1對(duì)SRA01/04細(xì)胞中NF-кBp65核轉(zhuǎn)位、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平的影響。 免疫熒光顯示,正常組(0μmol/L SIN-1) NF-кBp65主要分布在細(xì)胞漿內(nèi),細(xì)胞核內(nèi)未見或很少。不同濃度SIN-1與SRA01/04細(xì)胞共孵育20min后,呈濃度依賴性增加NF-кBp65核轉(zhuǎn)位。其中以50μmol/L SIN-1組和100μmol/L SIN-1組作用較為明顯。 Western blotting結(jié)果顯示,10μmol/L SIN-1組的核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(1.34±0.37)及其硝基化水平(0.66±0.11)較正常組核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(0.68±0.19)及其硝基化水平(0.28±0.07)增加較為明顯(P0.05)。50μmol/L SIN-1組的核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(1.87±0.35)及其硝基化水平(0.95±0.18)和100μmol/L SIN-1組的核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(2.40±0.63)及其硝基化水平(1.08±0.19)較其他組核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量增加最為明顯(P0.05),兩組間無(wú)明顯差異。0μmol/LSIN-1組、250μmol/LSIN-1組、500μmol/LSIN-1組三組之間無(wú)明顯差異。提示50~100μmol/L為SIN-1作用的最有效濃度范圍。內(nèi)參Histone表達(dá)基本一致。(見Fig.5和Fig.6) 4不同濃度FeTPPS對(duì)高糖(25mmol/L)狀態(tài)下SRA01/04細(xì)胞中NF-кBp65核轉(zhuǎn)位、核內(nèi)蛋白含量及其硝基化水平的影響。 免疫熒光顯示,正常組(0μmol/L FeTPPS) NF-кBp65主要分布在細(xì)胞核內(nèi)。不同濃度FeTPPS+25mmol/L高糖與SRA01/04細(xì)胞共孵育20min后,可見25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L FeTPPS三組中NF-кBp65核轉(zhuǎn)位大量減少。 Western blotting結(jié)果顯示,25μmol/L FeTPPS組的核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(1.63±0.28)及其硝基化水平(0.38±0.09)、50μmol/L FeTPPS組的核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(1.62±0.42)及其硝基化水平(0.44±0.12)及100μmol/L FeTPPS組的核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(1.35±0.38)及其硝基化水平(0.34±0.09)較正常組核內(nèi)NF-кBp65的蛋白含量(2.51±0.26)及其硝基化水平(0.88±0.17)降低較為明顯(P0.05)。這三組之間無(wú)明顯差異。提示25~100μmol/L為FeTPPS的最有效濃度范圍。0μmol/L、5μmol/L和10μmol/L FeTPPS這三組之間無(wú)明顯差異。內(nèi)參Histone表達(dá)基本一致。(見Fig.7和Fig.8) 結(jié)論: 1高糖可引起人晶狀體上皮細(xì)胞中NF-кB的核轉(zhuǎn)位。 2高糖狀態(tài)下,人晶狀體上皮細(xì)胞中NF-кB的核內(nèi)蛋白含量增加。 3高糖可致人晶狀體上皮細(xì)胞中NF-кB的硝基化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R776.1

【參考文獻(xiàn)】

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1 郝麗娜;凌毅群;羅秀梅;毛宇湘;毛綺妍;何守志;凌亦凌;;葛根素減輕部分由過(guò)氧亞硝基陰離子導(dǎo)致的糖尿病大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡(英文)[J];生理學(xué)報(bào);2006年06期

2 郝麗娜,毛綺妍,凌亦凌,何守志;糖尿病大鼠白內(nèi)障形成中的基因表達(dá)及生化變化[J];眼科研究;2005年03期

3 郝麗娜,凌亦凌,谷振勇,黃新莉,何守志;葛根素對(duì)糖尿病大鼠白內(nèi)障過(guò)程中晶狀體誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的影響[J];中國(guó)病理生理雜志;2004年04期

4 郝麗娜,凌亦凌,何守志,毛綺妍,梁俊清;過(guò)氧亞硝基陰離子在大鼠糖尿病性白內(nèi)障形成中的作用及葛根素的對(duì)抗作用[J];中華眼科雜志;2004年05期

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本文編號(hào)：1930777