本文選題：Math1基因 + 耳蝸毛細胞��； 參考：《蘭州大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 在哺乳動物聽覺系統(tǒng)中,感覺神經(jīng)終末細胞—耳蝸毛細胞,它能夠?qū)⒙暣碳まD(zhuǎn)換成電信號,并通過聽覺神經(jīng)傳導(dǎo)至中樞,以便維持正常的聽力。過度聲刺激、老化、耳毒性藥物(如氨基糖苷類抗生素、抗瘧藥、抗腫瘤藥、袢利尿劑等)、感染(如風疹、流行性腦膜炎、流行性腮腺炎等)及自身免疫性疾病等多種因素均可引發(fā)耳蝸毛細胞的不可逆性損傷,從而導(dǎo)致永久性的感音神經(jīng)性耳聾。目前對于感音神經(jīng)性耳聾的治療,主要利用放大設(shè)備(助聽器)和電刺激聽覺神經(jīng)元的設(shè)備(耳蝸植入),但目前這兩種臨床治療方法受到多種因素,如患者的耳聾程度、病程、年齡、受教育程度等多方面的影響,并且,即使使用助聽器或耳蝸植入后,仍有部分患者不能改善聽力,現(xiàn)在需要一種新的治療方法用于臨床,為更多的耳聾患者服務(wù)。運用促使非感覺上皮細胞向毛細胞分化的關(guān)鍵基因,是重建耳蝸Corti's結(jié)構(gòu),恢復(fù)聽功能的可行方法。近20年,已有報道關(guān)于Mathl對正常體外培養(yǎng)基底膜使毛細胞增多的結(jié)果,但是,對于耳毒性藥物損傷后的離體培養(yǎng)的耳蝸基底膜,導(dǎo)入Mathl后毛細胞的變化情況,目前還沒有相關(guān)研究。本研究利用腺病毒載體將誘導(dǎo)毛細胞分化的關(guān)鍵基因---Math1導(dǎo)入到藥物性損傷后離體培養(yǎng)的基底膜中,利用免疫組織化學(xué)染色、計數(shù)單位長度毛細胞等的方法,觀察毛細胞數(shù)量的變化,研究分以下兩個部分。 第一部分新生大鼠耳蝸毛細胞損害離體動物模型的建立 本部分研究的目的是建立耳毒性藥物損傷離體動物模型,用于耳蝸毛細胞再生的離體實驗研究。 選取出生后0天(PO)的健康SD大鼠,在超凈臺內(nèi),在放大倍數(shù)為20-40倍的體視學(xué)顯微鏡下,用游絲鑷完整剝?nèi)≌麄�耳蝸基底膜,然后將其按照本身的螺旋方式平鋪于六孔板中,加入含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在含有5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),培養(yǎng)12小時后,可見整齊排列的一排內(nèi)毛細胞和三排外毛細胞。實驗可分為對照組和3個實驗組,將不同濃度硫酸新霉素(1mmol/L,2mmol/L, 4mmol/L)分別加入正常培養(yǎng)12小時的基底膜中,繼續(xù)培養(yǎng)24小時后,終止實驗,然后進行MyosinⅦa免疫組織化學(xué)染色,在共聚焦顯微鏡下觀察各回毛細胞缺失情況,并分別選取10個圖片進行毛細胞計數(shù)(100μm),利用CHISS軟件進行統(tǒng)計分析。加入硫酸新霉素后,耳蝸毛細胞損傷從底回外毛細胞開始,隨著藥物濃度增加,逐漸累及到中回,最后頂回受累,以外毛細胞為甚。以上結(jié)果說明,體外培養(yǎng)的耳蝸毛細胞隨著硫酸新霉素藥物濃度的增加損失越嚴重,且從底回向頂回發(fā)展,此與活體動物實驗的損害規(guī)律基本相同,因此可作為耳毒性損傷后毛細胞再生研究的離體動物模型。 第二部分腺病毒攜帶Math1基因轉(zhuǎn)染損傷后新生大鼠耳蝸的實驗觀察 本部分的研究目的是觀察Math1基因?qū)﹄x體培養(yǎng)藥物性損傷后耳蝸毛細胞的影響。在第一部分的基礎(chǔ)上,對耳毒性藥物損傷后耳蝸毛細胞再生做初步的研究。 選取40個耳蝸基底膜,隨機分為4組：正常對照組、硫酸新霉素處理組、硫酸新霉素處理+ad-Math1-EGFP組和硫酸新霉素處理+ad-EGFP組,每組10個耳蝸。Mathl基因成功轉(zhuǎn)染后,利用MyosinⅦa免疫組織化學(xué)染色觀察耳蝸毛細胞變化。結(jié)果顯示：硫酸新霉素處理+ad-Math1-EGFP組在Math1基因成功轉(zhuǎn)染后10天,除螺旋神經(jīng)節(jié)部位有綠色熒光表達外,在受損毛細胞區(qū)域的支持細胞也有綠色熒光表達,而正常對照組、硫酸新霉素處理組、硫酸新霉素處理+ad-EGFP組,在毛細胞區(qū)域幾乎無綠色熒光表達。說明,Math1基因可以轉(zhuǎn)染受損毛細胞區(qū)域的支持細胞,提示該區(qū)域的支持細胞可以向耳蝸毛細胞轉(zhuǎn)化。
[Abstract]:In the auditory system of mammals, the terminal cells of the sensory nerve, cochlear hair cells, can convert sound stimuli into electrical signals and transmit to the center through the auditory nerve to maintain normal hearing. Excessive sound stimulation, aging, ototoxic drugs (such as aminoglycoside antibiotics, antimalarial drugs, antineoplastic agents, loop diuretics, etc.), infection (like the wind) A variety of factors such as rash, epidemic meningitis, mumps, and autoimmune diseases can cause irreversible damage to the hair cells of the cochlea, resulting in permanent sensorineural deafness. Current treatment of sensorineural hearing loss mainly uses equipment (ears) to amplify (hearing aids) and electrical stimulation of auditory neurons (ears). There are many factors, such as the degree of deafness, the course of the disease, the age, the degree of education, and even the hearing aids or cochlear implants, there are still some patients who are not able to improve their hearing, and a new treatment is needed to be used in clinical and more deafness patients. Service. The use of key genes that promote the differentiation of non sensory epithelial cells to hair cells is a feasible way to reconstruct the Corti's structure of the cochlea and restore the auditory function. In the last 20 years, it has been reported that Mathl has resulted in the increase of hair cells in the normal basement membrane in vitro. However, the cochlear basement membrane in vitro culture after the ototoxic drug damage is guided. There is no related study on the change of hair cells after entering Mathl. This study uses the adenovirus vector to induce the key gene ---Math1 to induce the differentiation of hair cells into the basement membrane of the isolated culture after the drug injury. The study is divided into two parts.
The first part is the establishment of neonatal rat cochlear hair cell damage model in vitro.
The aim of this study is to establish an animal model of ototoxic drug injury in vitro and to study the regeneration of cochlear hair cells in vitro.
In a healthy SD rat 0 days after birth (PO), the whole cochlear basement membrane was completely stripped with a swimming tweezers under a stereological microscope with a magnification of 20-40 times. Then a DMEM medium containing 5% fetal bovine serum was added to the six hole plate according to its own spiral mode, and was cultured in a 5%CO2 incubator. After 12 hours of culture, a row of neatly arranged inner hair cells and three xenophobic hair cells can be seen. The experiment can be divided into control group and 3 experimental groups, adding different concentrations of neomycin sulfate (1mmol/L, 2mmol/L, 4mmol/L) to normal culture for 12 hours of basal membrane, continuing to culture for 24 hours, terminating the experiment, and then conducting Myosin VII a immunization The loss of hair cells was observed under the confocal microscope, and 10 pictures were selected to count the hair cells (100 m), and the CHISS software was used to analyze the hair cells. After adding neomycin sulfate, the damage of the cochlear hair cells started from the bottom of the hair cells. With the increase of the drug concentration, the hair cells were gradually involved in the middle gyrus, and the final apex was involved. The above results indicate that the loss of cochlear hair cells in vitro is more serious with the increase of neomycin sulfate concentration, and it develops from the bottom back to the top, which is basically the same as in vivo animal experiments. Therefore, it can be used as an isolated animal model for the study of hair cell regeneration after ototoxicity.
The second part of adenovirus carrying Math1 gene transfected into neonatal rat cochlea after injury.
The purpose of this part is to observe the effect of Math1 gene on the cochlear hair cells after the drug induced injury in vitro. On the basis of the first part, a preliminary study of the cochlear hair cell regeneration after the ototoxic drug damage is made.
40 cochlear basement membranes were selected and randomly divided into 4 groups: normal control group, neomycin sulphate treatment group, neomycin sulphate treatment group +ad-Math1-EGFP and neomycin sulfate treatment group +ad-EGFP. 10 cochlear.Mathl genes in each group were transfected successfully. The changes of cochlear hair cells were observed by Myosin VII a immuno histochemical staining. The results showed: new sulfuric acid 10 days after the successful transfection of Math1 gene, 10 days after the successful transfection of mycophenolate gene, there was green fluorescent expression in the damaged hair cell area except for the green fluorescence expression in the part of the spiral ganglion, while the normal control group, neomycin sulfate treatment group, neomycin sulphate treatment + ad-EGFP group had almost no green fluorescence expression in the hair cell region. It indicates that Math1 gene can be transfected into Sertoli cells in damaged hair cells, suggesting that Sertoli cells in the region can be transformed into cochlear hair cells.
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R764

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本文編號：1914582