本文選題：蛔蟲 + 過敏原�。� 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：蛔蟲是人體常見寄生蟲,蛔蟲感染人體后可以引起許多疾病,其中過敏性疾病是其中的常見疾病,蛔蟲可以通過分泌過敏原的方式直接致敏機(jī)體,引起蛔蟲過敏性疾病。在蛔蟲的過敏原中,ABA-1蛋白(Ascaris body fluid allergen 1)是一種重要的過敏原,它是一類蛋白的總稱,有A和B兩類蛋白組成,其中A類蛋白有A4、A3、A2、A1四種組成,而B類蛋白只有B1一種。 在蛔蟲過敏性疾病的治療中,脫敏治療被認(rèn)為是一種可以從病因?qū)W方面進(jìn)行治療的有效方法,脫敏治療需要有較高純度的脫敏制劑和完整的抗原表位,在國內(nèi)的許多研究中對(duì)于蛔蟲過敏原的研究主要采用蛔蟲粗提液的方法,這就增加了脫敏治療的危險(xiǎn)性,而在國外的研究中主要采用ABA-1蛋白中的主要蛋白ABA-1A1,而忽略了其他蛋白的作用；另一方面,蛔蟲還可以通過免疫調(diào)節(jié)的方法,改變機(jī)體的免疫平衡方向,使機(jī)體更易患過敏性疾病�；紫x感染人體后,有一部分可以刺激機(jī)體產(chǎn)生蛔蟲抗體,大量研究證明哮喘與蛔蟲抗體之間存在一定的聯(lián)系,過敏性鼻炎與哮喘屬于同一氣道,同一疾病,而蛔蟲抗體與過敏性鼻炎發(fā)病之間關(guān)系的研究較少報(bào)道。 為此,為了解決蛋白純度和完整抗原表位的問題,以及探討蛔蟲抗體與過敏性鼻炎發(fā)病之間的關(guān)系,我們進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn),試圖得到高純度和完整抗原表位的蛔蟲過敏原融合蛋白,并初步說明蛔蟲抗體與過敏性鼻炎之間的關(guān)系；同時(shí),我們克隆表達(dá)ABA-1蛋白中的主要蛋白ABA-1A1,為融合蛋白和單體蛋白的免疫學(xué)及功能研究比較奠定基礎(chǔ)。 第一章蛔蟲過敏原ABA-1融合基因的表達(dá)及鑒定 一、目的 重組并優(yōu)化蛔蟲過敏原ABA-1主要基因,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛔蟲主要過敏原ABA-1融合蛋白,純化并鑒定目的融合蛋白,為免疫治療、作用機(jī)制研究及臨床診斷提供物質(zhì)基礎(chǔ)。 二、方法 從Gene Bank (AF051702)和Protein database (Q06811)中獲取蛔蟲主要過敏原ABA-1基因和蛋白序列,根據(jù)ABA-1B1、ABA-1A4、ABA-1A3、ABA-1A2與ABA-1A1五種蛋白氨基酸序列之間的差異性,選擇差異較大的ABA-IB1、ABA-1A2與ABA-1A1基因進(jìn)行重組,并將新的融合基因命名為BAA,大小為1200 bp；根據(jù)大腸桿菌密碼子使用的偏愛性和氨基酸密碼子的兼并性原則,在不改變氨基酸順序的基礎(chǔ)上,將基因進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì),使優(yōu)化后的基因更有利于在大腸桿菌中翻譯；利用](?)NAStar軟件對(duì)融合基因的RNA折疊結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測,調(diào)整局部氨基酸密碼子,使RNA更有利于表達(dá)。優(yōu)化設(shè)計(jì)后的融合基因BAA送人工合成,將合成的基因BAA構(gòu)建于表達(dá)載體PET-44a上,重組的質(zhì)粒命名為PET-44a-BAA,然后經(jīng)KCM法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109中進(jìn)行克隆,經(jīng)Amp抗性平板篩選后,提取PET-44a-BAA質(zhì)粒,經(jīng)NdeⅠ和Pst I雙酶切及DNA測序正確后,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌RosettaBlueTM中,經(jīng)Amp抗性平板篩選后,提取PET-44a-BAA質(zhì)粒,經(jīng)NdeⅠ和PstⅠ雙酶切及DNA測序正確后,37℃空氣浴、IPTG誘導(dǎo)表達(dá),新的表達(dá)蛋白命名為融合蛋白BAA,取1.5 mL 10000 rpm離心1 min收集菌體,利用12%的SDS-PAGE鑒定目標(biāo)蛋白表達(dá)情況；融合蛋白BAA菌體經(jīng)超聲破碎后,12%的SDS-PAGE膠判斷其主要存在于上清還是包涵體,并利用Ni柱親和層析純化；融合蛋白BAA通過Western Blot和氨基酸測序鑒定其過敏原性和是否為目的蛋白。 三、結(jié)果 1、構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒PET-44a-BAA 大腸桿菌JM109和大腸桿菌RosettaBlueTM中的PET-44a質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和PstⅠ雙酶切鑒定,在1200 bp處可見有一特異條帶,與目的條帶大小相符；經(jīng)DNA測序,與目的基因進(jìn)行Blast比對(duì)分析,PET-44a上插入的基因序列與目的基因的序列同源性達(dá)到100%。這表明,已成功構(gòu)建PET-44a-BAA質(zhì)粒。 2、表達(dá)并純化出融合蛋白BAA 成功在大腸桿菌RosettaBlueTM中誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白BAA,其誘導(dǎo)條件為,37℃空氣浴200rpm振蕩培養(yǎng)100 min,至菌液OD值在0.6-0.7之間,加入IPTG,濃度為0.5 mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)3 h,12%的SDS-PAGE鑒定,在45 KD處可見一特異目的條帶,其表達(dá)量經(jīng)粗測約占總蛋白的40%左右。經(jīng)超聲裂解12%的SDS-PAGE鑒定后發(fā)現(xiàn),融合蛋白BAA主要存在于上清中；上清蛋白經(jīng)Ni柱親和層析,但按照非變性條件(緩沖液中未加入6 mol/L尿素),未能得到純化結(jié)果,在6 mol/L尿素變性條件下,得到了較為理想的純化結(jié)果,純化后蛋白純度可達(dá)90%左右。 3、鑒定了目的蛋白BAA 融合蛋白BAA用蛔蟲過敏血清經(jīng)免疫印跡檢測后發(fā)現(xiàn),45 KD處可見一特異目的條帶,經(jīng)氨基酸測序,結(jié)果顯示N端15個(gè)氨基酸為T M E H Y L K T Y L S W L T E,經(jīng)BLAST比對(duì)分析,證明該蛋白為目的融合蛋白BAA。 4、成功優(yōu)化了融合基因BAA 經(jīng)對(duì)融合基因BAA及融合蛋白BAA的鑒定正確說明,融合基因BAA得到了成功優(yōu)化。 四、結(jié)論 蛔蟲過敏原基因ABA-1可以進(jìn)行重組優(yōu)化,重組優(yōu)化后的基因BAA在大腸桿菌中得到高效的表達(dá),融合蛋白BAA經(jīng)Ni柱親和層析可以得到較高的純度,經(jīng)鑒定融合蛋白為目的蛋白。 第二章蛔蟲過敏原ABA-1A1的表達(dá)及鑒定 一、目的 利用PCR技術(shù)克隆蛔蟲過敏原ABA-1A1基因,構(gòu)建pET-44a-ABA-1Al表達(dá)載體,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛔蟲ABA-1A1蛋白,為與融合蛋白BAA的免疫原性及抗原性比較提供物質(zhì)基礎(chǔ),為蛔蟲過敏原的過敏性改造奠定基礎(chǔ)。 二、方法 設(shè)計(jì)PCR引物A1F:5'CAGCACATACCTCTCGTCGCG3, A1R: 5'AGAGGTATGCACACCATAGATCTTC3',利用PCR方法從融合基因BAA中轉(zhuǎn)錄ABA-1A1基因,利用TA克隆技術(shù)將其構(gòu)建于pEASY2-T3載體上,經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR和DNA測序正確后,利用NdeⅠ和PstⅠ將質(zhì)粒pEASY2-T3-ABA-1A1雙酶切后,將ABA-1A1基因構(gòu)建于表達(dá)載體PET-44a上,經(jīng)KCM法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109中進(jìn)行克隆,PET-44a-ABA-1A1經(jīng)NdeⅠ和PstⅠ雙酶切及DNA測序正確后,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌RosettaBlueTM中,經(jīng)鑒定正確后,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),12% SDS-PAGE檢測表達(dá)結(jié)果,通過Western Blot鑒定目的蛋白；取ABA-1A1菌體,超聲破碎后,分別對(duì)上清和沉淀進(jìn)行12%SDS-PAGE檢測；ABA-1A1蛋白經(jīng)Ni柱親和層析進(jìn)行純化。 三、結(jié)果 1、構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒PET-44a-ABA-1A1 大腸桿菌JM109和大腸桿菌RosettaBlueTM中的PET-44a質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和PstI雙酶切鑒定,在400bp處可見有一特異條帶,與目的條帶大小相符；經(jīng)DNA測序,與目的基因進(jìn)行Blast比對(duì)分析,PET-44a上插入的基因序列與目的基因的序列同源性達(dá)到100%。這表明,已成功構(gòu)建PET-44a-ABA-1A1質(zhì)粒。 2、表達(dá)并純化出融合蛋白ABA-1A1 成功在大腸桿菌RosettaBlueTM中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白ABA-1A1,其誘導(dǎo)條件為,37℃空氣浴200 rpm振蕩培養(yǎng)100 min,至菌液OD值在0.6-0.7之間,加入IPTG,濃度為0.5 mmol/L,誘導(dǎo)表達(dá)3h,12%SDS-PAGE鑒定,在15 KD處可見一特異目的條帶。經(jīng)超聲裂解12%SDS-PAGE鑒定后發(fā)現(xiàn),融合蛋白ABA-1A1主要存在于上清中；上清蛋白經(jīng)Ni柱親和層析,得到了較高純度的ABA-1A1蛋白。 3、鑒定了目的蛋白BAA 蛋白ABA-1A1用蛔蟲過敏血清經(jīng)免疫印跡檢測后發(fā)現(xiàn),15 KD處可見一特異目的條帶,證明該蛋白為目的蛋白ABA-1A1。 四、結(jié)論 ABA-1A1在大腸桿菌中得到高效的表達(dá),這為與融合蛋白BAA的免疫學(xué)活性研究比較、蛔蟲脫敏疫苗研制及過敏原性改造奠定了基礎(chǔ)。 第三章蛔蟲過敏原融合蛋白在過敏性鼻炎發(fā)病機(jī)制作用中的研究 一、目的 探討過敏性鼻炎與蛔蟲抗體之間的聯(lián)系 二、方法 收集過敏性鼻炎病人及健康人的血清,用融合蛋白BAA做為抗原,利用Wetern Blot方法,檢測過敏性鼻炎患者中含有蛔蟲過敏原抗體的人數(shù),與健康人蛔蟲抗體陽性人數(shù)進(jìn)行比較,探討蛔蟲感染與過敏性鼻炎發(fā)病之間的可能聯(lián)系。 三、結(jié)果 在32個(gè)過敏性鼻炎患者中,有10個(gè)患者的蛔蟲過敏原抗體陽性,抗體陽性率為31.25%,在26個(gè)健康對(duì)照有2個(gè)人蛔蟲抗體陽性,蛔蟲抗體陽性率為7.69%,對(duì)過敏性鼻炎和健康人的蛔蟲抗體陽性率進(jìn)行比較,經(jīng)X2檢驗(yàn)得P0.05,兩者的差異具有顯著性。 四、結(jié)論 蛔蟲抗體可能與過敏性鼻炎發(fā)病有一定的關(guān)系,有可能成為一個(gè)潛在危險(xiǎn)因素。 全文結(jié)論 利用大腸桿菌密碼子偏嗜性的特點(diǎn),對(duì)融合基因BAA進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)后,可以在大腸桿菌中得到高效的表達(dá),并得到純度高抗原表位豐富的融合蛋白BAA；利用PCR方法可以得到蛔蟲過敏原ABA-1A1基因,并在順利表達(dá)、純化并鑒定了A1蛋白,為與融合蛋白BAA的免疫學(xué)及功能比較奠定了基礎(chǔ)；利用融合蛋白BAA作為抗原經(jīng)Western Blot調(diào)查后發(fā)現(xiàn),蛔蟲感染可能與過敏性鼻炎發(fā)病有密切關(guān)系,可能是過敏性鼻炎發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因素。
[Abstract]:Ascaris lumbricoides ( Ascaris lumbricoides ) is a common disease in human body . Ascaris lumbricoides can cause many diseases after being infected with human body . The allergic disease is a common disease among them . Ascaris lumbricoides can be directly sensitized by secreting allergen to cause ascarid allergic disease . In the allergen of Ascaris lumbricoides , the ABA - 1 protein ( Ascaris body fluid ) is an important allergen .

In the treatment of allergic diseases of Ascaris lumbricoides , the desensitizing treatment is regarded as an effective method which can be used for the treatment of ascaris .
On the other hand , the Ascaris lumbricoides can change the immune balance direction of the organism by the method of immunoregulation , so that the organism is more susceptible to allergic diseases . After the Ascaris lumbricoides is infected with the human body , a part of the Ascaris lumbricoides can stimulate the organism to produce ascaris antibody , and a large number of studies prove that there is a certain connection between the asthma and the ascaris antibody , and the allergic rhinitis and the asthma belong to the same airway and the same disease , and the research on the relationship between the Ascaris antibody and the allergic rhinitis is less .

In order to solve the problem of protein purity and complete antigenic epitopes , and to explore the relationship between ascarid antibody and allergic rhinitis , we conducted this experiment to obtain ascarid allergen fusion protein with high purity and intact antigen epitopes , and preliminarily explain the relationship between ascarid antibody and allergic rhinitis ;
At the same time , we cloned the main protein ABA - 1A1 in the expression of ABA - 1 , which lays the foundation for the immunology and functional research of fusion protein and monomer protein .

The Expression and Identification of ABA - 1 Fusion Gene of Ascaris lumbricoides

I . Purpose

The main gene of Ascaris lumbricoides allergen ABA - 1 was optimized and optimized . The expression system of E . coli was used to express ABA - 1 fusion protein of Ascaris lumbricoides . The fusion protein was purified and identified . It provided a material basis for immunotherapy , mechanism of action and clinical diagnosis .

II . Methodology

ABA - 1gene and protein sequence were obtained from Gene Bank ( AF051702 ) and Protein database ( Q06811 ) . ABA - 1B1 , ABA - 1A4 , ABA - 1A3 , ABA - A2 and ABA - 1A1 were selected for recombination , and the new gene was named BAA with a size of 1200 bp .
According to the compatibility principle of the preference and the amino acid codon used by the escherichia coli codon , the gene is optimized and designed without changing the amino acid sequence , so that the optimized gene is more favorable for translation in Escherichia coli ;
The RNA folding structure of fusion gene was predicted by using NAStar software , and the local amino acid codon was adjusted to make RNA more favorable for expression . The synthesized gene BAA was constructed on the expression vector PET - 44a . The recombinant plasmid named PET - 44a - BAA was transformed into E . coli RosettaBlue TM . After screening with Amp resistance plate , the recombinant plasmid was transformed into E . coli RosettaBlue TM . After the screening of Amp resistant plate , the recombinant plasmid was transformed into E . coli RosettaBlue TM .
After ultrasonic crushing of the fusion protein BAA , 12 % SDS - PAGE gel was used to determine whether it existed mainly in the supernatant or inclusion body , and purified by affinity chromatography on Ni column ;
The fusion protein BAA identified its allergenicity and its target protein by Western Blot and amino acid sequencing .

III . Results

1 . The expression plasmid PET - 44a - BAA was constructed .

The PET - 44a plasmids were identified by Nde I and Pst 鈪，

本文編號(hào)：1867844