本文選題：miR-431 + 轉基因小鼠�。� 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2014年博士論文

【摘要】：第一部分基礎研究：基因表達譜分析miR-431導致小鼠耳聾的分子機制 目的：miR-431轉基因小鼠ABR反應閾值升高,提示miR-431可能參與遺傳性耳聾的調控。本研究通過基因表達譜分析,篩選鑒定miR-431轉基因與野生型小鼠內耳組織中差異表達的基因,為探討miR-431導致小鼠耳聾的分子機制奠定基礎。 方法：提取ABR反應閾值升高的miR-431轉基因小鼠和ABR反應閾值正常的野生型小鼠耳蝸總RNA,進行RNA測序。通過對測序結果進行生物信息學分析及GO注釋,得到差異表達基因。然后,通過miR-431靶基因預測和遺傳性耳聾基因信息庫交叉篩選,得到miR-431介導的調控遺傳性聾的候選基因。最后,通過Real-time RT-PCR方法驗證RNA-seq數(shù)據(jù)可靠性；通過基因克隆、雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)(Luciferase)驗證miR-431靶基因。 結果： 1、miR-431轉基因小鼠ABR反應閾較野生型小鼠升高。A系Tg組小鼠平均聽閾為42.3±14.7dB SPL,Wt組小鼠平均聽閾為27.3±6.9dB SPL; B系Tg小鼠平均聽閾為34.8±6.9dB SPL, Wt小鼠平均聽閾為27.5±4.5dB SPL。 2、通過分析得到miR-431轉基因小鼠較野生型小鼠表達差異大于1.5倍的基因2344個,大于2倍的有921個。其中上調基因,大于100倍的7個,10-100倍的77個,2-10倍的627個；其中下調基因大于100倍的4個,10-100倍的12個,2-10倍的194個。 3、通過差異表達基因與遺傳性耳聾基因突變數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析,得到16個表達變化的耳聾基因,其中14個基因在Tg小鼠中表達下調,它們是CLDN14.COL11A2、 COL2A1、COL4A4、COL9A2、ESRRB、GJB2.MITF、OTOF, POU4F3, SEMA3E、 SIX5、SOX10、USH1C。2個基因表達上調,它們是：GJB3、GRHL2。 4、通過差異表達基因與遺傳性耳聾基因突變數(shù)據(jù)庫和miR-431預測的靶基因數(shù)據(jù)集做聯(lián)合分析,鑒定了8個基因可能是miR-431介導的調控遺傳性聾的候選基因,COL4A4、ESRRB、GJB2、MITF、OTOF、USH1C、SEMA3E和GRHL2。 5、Real-time RT-PCR方法驗證了8個基因與RNA-seq結果一致。 6、雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證COL4A4、SEMA3E是miR-431調控的靶基因。 結論：miR-431可能通過調控COL4A4、SEMA3E表達影響小鼠聽力。 第二部分臨床研究：小耳畸形患兒聽覺發(fā)育研究 目的：比較雙側先天性耳道閉鎖、小耳畸形兒童與聽力正常兒童聽力及早期聽覺發(fā)育的差別,分析佩戴軟帶骨錨式助聽器(Bone-anchored hearing aid, Baha)對患兒改善聽力及聽覺發(fā)育的影響。 方法：軟帶Baha組共16例雙側先天性耳道閉鎖、小耳畸形兒童,4歲組6例,4-6歲組10例,29例正常聽力兒童作為對照組。4歲組患兒分別在3個測試時間點(佩戴軟帶Baha前、佩戴6個月及12個月后)應用嬰幼兒有意義聽覺整合量表(Infant-Toddler Meaningful Auditory Integration Scale, IT-MAIS)評估聽覺發(fā)育情況。4-6歲組患兒分別在3個測試時間點應用有意義聽覺整合量表(Meaningful Auditory Integration Scale, MAIS)評估聽覺發(fā)育情況,并在聲場下行純音測聽(pure tone audiometry, PTA)及應用普通話詞匯相鄰性單音節(jié)及雙音節(jié)詞表(Chinese Mandarin lexical neighborhood test, MLNT)檢測言語識別率。 結果：4歲組患兒在3個測試時間點的IT-MAIS平均得分分別為41±24%、60±22%和73±7%。4-6歲組患兒在3個測試時間點的MAIS平均得分分別為66±7%、90±5%和99±2%。4-6歲組患兒聲場下裸耳平均聽閾為63±6dB HL,佩戴軟帶Baha后聽閾提高至31±4dB HL。應用雙音節(jié)易詞測得的平均言語識別率(speech discrimination score, SDS)為74±19%、86±16%和95±4%；雙音節(jié)難詞平均SDS為48±18%、73±15%和81±7%；單音節(jié)易詞平均SDS為55±17%、74±22%和83±14%；單音節(jié)難詞平均SDS為31±14%、61±15%和71±13%。 結論：雙側先天性耳道閉鎖、小耳畸形兒童早期佩戴軟帶Baha能夠有效提高聽力,聽覺發(fā)育水平可接近健聽嬰幼兒。
[Abstract]:Part one basic research: molecular mechanism of miR-431 induced deafness in mice by gene expression profiling
Objective: the threshold of ABR reaction in miR-431 transgenic mice increased, suggesting that miR-431 might be involved in the regulation of hereditary deafness. This study screened the differentially expressed genes in the inner ear tissues of miR-431 transgenic mice and wild type mice by gene expression spectrum analysis, which laid the foundation for the study of the molecular mechanism of miR-431 causing deafness in mice.
Methods: miR-431 transgenic mice with elevated ABR reaction threshold and wild mouse cochlear total RNA with normal ABR reaction threshold were sequenced. The differentially expressed genes were obtained by bioinformatics analysis and GO annotation of the sequencing results. Then, the cross screening of the miR-431 target gene pre test and genetic deafness gene information library was carried out. The candidate genes regulating genetic deafness mediated by miR-431 were obtained. Finally, the Real-time RT-PCR method was used to verify the reliability of the RNA-seq data, and the miR-431 target gene was verified by the gene cloning and the dual luciferase reporter gene system (Luciferase).
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本文編號：1820219