本文選題：脈絡(luò)膜新生血管 + G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子5��； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】：研究背景脈絡(luò)膜新生血管(CNV)是眼內(nèi)新生血管的重要表現(xiàn)形式之一,常導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪失,其生成是一個(gè)十分復(fù)雜的過程,受多種因素或因子精細(xì)而敏感的調(diào)控。Bruch膜損傷和缺氧是CNV形成的重要機(jī)制,前者可降低營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸能力和增加脂質(zhì)沉積,導(dǎo)致Bruch膜發(fā)生斷裂,新生血管通過斷裂的Bruch膜長入視網(wǎng)膜下間隙;后者可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞數(shù)量和功能改變,釋放多種細(xì)胞因子,導(dǎo)致RPE-Bruch膜-脈絡(luò)膜毛細(xì)血管復(fù)合體完整性破壞,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生和移行,最終形成新生血管。 G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)子5(RGS5)屬于RGS蛋白超家族中的R4/B亞科,不僅負(fù)向調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體相結(jié)合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),還能抑制該通路下游的酪氨酸激酶激活小G蛋白/絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的激活,與缺氧及病理性新生血管形成密切相關(guān),且這一作用可能與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)有關(guān)。VEGF是RPE細(xì)胞分泌的因子之一,在CNV的發(fā)生中起著重要的作用。貝伐單抗(Avastin)作為抗VEGF重組單克隆抗體,能阻斷VEGF-A所有亞型與內(nèi)皮細(xì)胞表面受體的結(jié)合,通過抑制VEGF活性,達(dá)到有效阻礙CNV形成的目的。 目的探討RGS5參與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性CNV生成及在體外缺氧環(huán)境下RPE細(xì)胞中表達(dá)的可能機(jī)制。 方法(1)532nm激光誘導(dǎo)88只(176眼)雄性棕色挪威(BN)大鼠實(shí)驗(yàn)性CNV。首先按時(shí)間分為光凝后1d(n=6)、3d(n=6)、7d(n=7)和14d(n=21)四組,觀察RGS5及VEGF的表達(dá);選取光凝7d(n=12)和14d(n=36)作觀察點(diǎn),按處理因素分為生理鹽水組及Avastin注射組,觀察通過特異性抑制VEGF表達(dá)對(duì)RGS5表達(dá)產(chǎn)生的影響;(2)在正常培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為200μM的CoCl2建立細(xì)胞化學(xué)缺氧模型。按缺氧時(shí)間分為0、1、3、6、12和24h六組,觀察RGS5和VEGF表達(dá)的變化;另選取12h和24h作觀察點(diǎn),按處理因素分為缺氧對(duì)照組和Avastin處理組,Avastin包括25μg/ml、100μg/ml和250μg/ml三種濃度,觀察抑制VEGF表達(dá)后RGS5表達(dá)的變化。采用組織病理學(xué)切片和脈絡(luò)膜鋪片分別觀察CNV厚度和面積;免疫熒光染色法、Western blot和RT-PCR分別檢測RGS5和VEGF蛋白與mRNA的表達(dá)。采用Student’s t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果(1)光凝后1d、3d、7d和14d,RGS5蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均于1d(t_(1d)=3.451,P 0.05;t_(1d)=3.646,P 0.05)和3d(t_(3d)=3.085,P 0.05;t_(3d)=3.888,P 0.05)下降,7d開始上升,14d(t_(14d)=2.079,P 0.05;t_(14d)=2.194,P 0.05)達(dá)到高峰;VEGF蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量均于7d(t_(7d)=7.959,P 0.01;t_(7d)=7.959,P 0.01)達(dá)到高峰,14d有所下降,但仍高于正常水平。RGS5表達(dá)高峰晚于VEGF出現(xiàn);玻璃體腔注射Avastin后,CNV生成的厚度和面積均減小(t=2.616,P 0.05;t=15.179,P = 0.000),光凝后7d VEGF蛋白和mRNA的表達(dá)及光凝后14d RGS5蛋白和mRNA的表達(dá)均下調(diào);(2)在上述結(jié)果基礎(chǔ)上,選擇RPE細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)得到,正常條件下RGS5主要表達(dá)于人RPE細(xì)胞胞漿中,與VEGF存在共表達(dá)區(qū)域。隨著缺氧時(shí)間的延長,RPE細(xì)胞中RGS5蛋白及mRNA表達(dá)逐漸上調(diào),24h時(shí)表達(dá)達(dá)高峰(0.932±0.104,t_(24)=3.106,P=0.011;0.742±0.083,t_(24)=2.852,P=0.017);VEGF蛋白及mRNA表達(dá)12h達(dá)到高峰(1.022±0.141,t_(12)=4.144,P=0.002;0.491±0.063,t_(12)=5.707,P=0.000),24h有所下降,但仍高于未缺氧的RPE細(xì)胞(0.942±0.125,t_(24)=3.306,P=0.008;0.425±0.080,t_(24)=3.239,P=0.011)。濃度為100μg/ml和250μg/ml的Avastin有效抑制VEGF蛋白(t_(100)=2.794,P=0.019;t_(250)=3.396,P=0.007)和mRNA(t_(100)=2.823,P=0.018;t_(250)=9.584,P=0.000)表達(dá)后,RGS5蛋白(t_(100)=2.953, P=0.014;t_(250)=2.913, P=0.015)和mRNA(t_(100)=3.009, P=0.013;t_(250)=4.243, P=0.002)表達(dá)受到抑制。 結(jié)論RGS5與VEGF表達(dá)和CNV生成相關(guān),且兩者表達(dá)有時(shí)相關(guān)系;通過抑制VEGF表達(dá)有效抑制CNV過程中,RGS5表達(dá)下調(diào)。在此基礎(chǔ)上體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,正常條件下RGS5表達(dá)于RPE細(xì)胞胞漿中,與VEGF存在共表達(dá)區(qū)域;RGS5和VEGF的表達(dá)具有時(shí)相關(guān)系,通過抑制VEGF,RGS5表達(dá)隨之降低。綜上提示RGS5可能位于VEGF信號(hào)通路下游,參與了VEGF相關(guān)的CNV生成機(jī)制,且與CNV發(fā)生相關(guān)的RGS5表達(dá)可能部分是RPE細(xì)胞源性的。
[Abstract]:Background Choroidal neovascularization ( CNV ) is one of the important manifestations of neovascularization in the eye , which often leads to severe loss of vision . It is a very complex process which is sensitive to various factors or factors . Bruch membrane damage and hypoxia are important mechanisms for CNV formation .

The G protein signal transduction regulator 5 ( RGS5 ) belongs to the R4 / B subfamily in the RGS protein superfamily , which not only negatively regulates the activation of the G protein coupled receptor , but also inhibits the activation of the tyrosine kinase activated small G protein / mitogen - activated protein kinase ( MAPK ) signal pathway downstream of the pathway , and plays an important role in the pathogenesis of CNV .

Objective To investigate the possible mechanism of RGS5 in the generation of experimental CNV and the expression of RGS5 in RPE cells in vitro .

Methods ( 1 ) The expression of RGS5 and VEGF was observed in 88 ( 176 eyes ) of male brown norway ( BN ) rats induced by 532 nm laser . The expression of RGS5 and VEGF was observed .

Results ( 1 ) The relative expression levels of RGS5 protein and mRNA in RPE cells decreased after 7 days ( t _ ( 1d ) = 3.451 , P 0.05 ; t _ ( d ) = 3.646 , P 0.05 ; t _ ( d ) = 3.085 , P 0.05 ; t _ ( 3d ) = 3.888 , P = 0.000 ) . t _ ( 24 ) = 3.106 , P = 0 . 011 ; 0 . 742 鹵 0 . 083 , t _ ( 24 ) = 2.852 , P = 0 . 017 ) ; VEGF protein and mRNA expression peaked at 12 h ( 1.022 鹵 0 . 141 , t _ ( 12 ) = 4.144 , P = 0.002 ; 0 . 491 鹵 0.063 , t _ ( 12 ) = 5.707 , P = 0.000 ) , but still higher than that of uninjured RPE cells ( 0.942 鹵 0.125 , t _ ( 24 ) = 3.306 , P = 0.008 ; 0.425 鹵 0.080 , t _ ( 24 ) = 3.239 , P = 0 . 011 ) . The expression of VEGF protein ( t _ ( 100 ) = 2.794 , P = 0.019 ; t _ ( 250 ) = 3.396 , P = 0.007 ) and mRNA ( t _ ( 100 ) = 2.823 , P = 0 . 018 ; t _ ( 250 )) = 2.823 , P = 0 . 014 ; t _ ( 250 ) = 2.913 , P = 0 . 015 ) and mRNA ( t _ ( 100 ) = 3.009 , P = 0 . 013 ; t _ ( 250 ) = 4.243 , P = 0.002 ) were inhibited .

Conclusion RGS5 is related to the expression of VEGF and CNV , and the expression of RGS5 is downregulated by inhibiting the expression of VEGF . In vitro , RGS5 is expressed in the cytoplasm of RPE cells , and the expression of RGS5 and VEGF is decreased .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R773.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1810786