發(fā)布時(shí)間：2018-04-27 01:06

  本文選題：鼻咽癌 + NPCEDRG基因　； 參考：《中南大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一種具有明顯種族和地區(qū)分布特征的上皮源性頭頸部惡性腫瘤。其病因涉及到遺傳因素、EB病毒的感染、飲食和某些環(huán)境中的化學(xué)致癌物的作用等。鼻咽癌的發(fā)生是一個(gè)多因素多步驟的病理過程,研究發(fā)現(xiàn)數(shù)十個(gè)與鼻咽癌相關(guān)的基因,其中抑瘤基因的失活更為普遍,如位于染色體3p21-3區(qū)的RASSF1A、BLU、LTF、LARS2、SEMA3B、SEMA 3F和GNAT1等候選抑瘤基因與鼻咽癌發(fā)生密切相關(guān)。本所對湖南鼻咽癌高發(fā)家系進(jìn)行連鎖分析,發(fā)現(xiàn)染色體3p21部分區(qū)域與湖南家族性鼻咽癌發(fā)病緊密連鎖。有研究證實(shí)在我國南方,正常鼻咽上皮和鼻咽癌前病變以及鼻咽癌組織存在3p染色體(包括3p21.3)丟失,這有力地證明染色體3p21.3區(qū)抑瘤基因的功能失活為鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的早期事件。 NPCEDRG基因是我們實(shí)驗(yàn)室采用基因定位候選克隆策略獲得的一個(gè)在正常鼻和鼻咽癌組織表達(dá)差異具有顯著性的基因,定位于染色體3p21-3,該點(diǎn)存在于湖南家族性鼻咽癌的遺傳易感區(qū)3p21.31-21.2區(qū)域內(nèi)。我們前期研究結(jié)果表明,NPCEDRG在部分鼻咽癌細(xì)胞系、鼻咽癌組織中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)NPCEDRG基因可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程,并部分逆轉(zhuǎn)CNE2的惡性表型,提示NPCEDRG基因可能為個(gè)鼻咽癌候選抑瘤基因。 為了揭示NPCEDRG基因在鼻咽癌細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào)的分子機(jī)制,更深入地闡明NPCEDRG基因的生物學(xué)功能,本研究應(yīng)用生物信息學(xué)對候選抑瘤基因NPCEDRG基因進(jìn)行全面分析,應(yīng)用5'-Race及3'-RACE及RT-PCR等技術(shù)對其選擇性剪接變異體進(jìn)行了探討,并對預(yù)期的蛋白異形體進(jìn)行了氨基酸序列的推導(dǎo)和功能預(yù)測。應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測NPCEDRG基因的啟動(dòng)子區(qū)域及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),成功克隆了其5’-端啟動(dòng)子區(qū)域,并利用缺失突變,報(bào)告基因、轉(zhuǎn)染技術(shù)對該該基因啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行初步鑒定,應(yīng)用電泳遷移阻滯分析實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)的分析順式作用元件。以期明確NPCEDRG基因在鼻咽癌發(fā)生機(jī)制中的功能提供一些線索。 [NPCEDRG基因結(jié)構(gòu)及同源性分析] 人NPCEDRG基因定位于湖南家族性鼻咽癌的遺傳易感區(qū)3p21.31-21.2區(qū)域內(nèi),其基因全長為6992 bp,由于剪接方式不同形成至少9種mRNA剪接變異體,編碼至少3種不同的蛋白質(zhì)。利用比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人NPCEDRG基因與黑猩猩、獼猴、狗、牛及小鼠等5種動(dòng)物高度同源,說明NICN1基因是一個(gè)比較保守的基因。 [生物信息學(xué)預(yù)測NPCEDRG基因表達(dá)調(diào)控元件] 利用多種生物信息學(xué)軟件對NPCEDRG基因5’-端上游調(diào)控區(qū)-3500～+500bp區(qū)域進(jìn)行分析。該區(qū)域存在2個(gè)CpG島,分別位于-1573～-960bp和-624～+265bp,其中-624～+265bp區(qū)域包含所有剪接變異體的第一外顯子及約600 bp的5’末端上游調(diào)控序列,提示該區(qū)域可能為NPCEDRG基因的啟動(dòng)子區(qū)域并且在基因表達(dá)過程中起重要的調(diào)控作用。NPCEDRG基因可能有多個(gè)TSS位于-225 bp～+137 bp區(qū)間,主要介于ATG上游-99 bp～-17 bp區(qū)間。Gene2promoter軟件分析TSS位于-73bp和-49 bp處,啟動(dòng)子介于-624 bp～+75 bp。PromoterInspector未預(yù)測到任何啟動(dòng)子區(qū)。綜合分析各軟件預(yù)測結(jié)果,初步確定NPCEDRG啟動(dòng)子區(qū)可能介于-624 bp～+75 bp區(qū)間。 選取人類NICN1基因5’末端上游調(diào)控區(qū)(-625bp～+250bp)875bp序列,采用Matlnspector V2.2軟件和TESS軟件搜索轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。如圖1-7所示,均未檢測到經(jīng)典的TATA保守序列,但包含CCAAT、SP1、AP1、AP2、STAT1、c-Myb、AREB6、Nkx2-5、ZF5、E2F1、CREBP1和RBPJK等重要調(diào)控元件。利用在線程序ECR Browser進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化足跡分析,結(jié)果顯示在人和小鼠等6物種間在-180 bp～+240 bp區(qū)間約420 bp序列高度保守,該保守區(qū)域中存在包括CCAAT, STAT1和SP1/SP1_Q2/SP1_Q6/E2F_Q2/ZF5/CACD等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。這些預(yù)測結(jié)果為進(jìn)一步鑒定NPCEDRG基因的啟動(dòng)子區(qū)及其調(diào)控元件,為探討其表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 [NPCEDRG基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)檢測及mRNA剪接變異體分析] 利用RT-PCR檢測11種鼻咽癌細(xì)胞及4種其他腫瘤細(xì)胞中NPCEDRG基因總體mRNA和AF538150 mRNA的表達(dá)情況,結(jié)果顯示NPCEDRG基因總mRNA表達(dá)在HK1和6-10B細(xì)胞中非常低,在其他細(xì)胞中表達(dá)相對較高；而AF538150 mRNA在HNE1、HNE2、HNE3、C666-1、HK1、HONE1、5-8F、6-10B、915及A549細(xì)胞中表達(dá)非常低,而在CNE1、CNE2、NP69、MCF7、HeLa及HL60細(xì)胞中其表達(dá)相對較高。 利用5'-RACE、3'-RACE和RT-PCR在CNE2細(xì)胞中進(jìn)行各種剪接變異體克隆、鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)至少有7種剪接變異體,編碼分別由213、171和98個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。NPCEDRG基因至少有7個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),分別位于起始密碼子ATG上游-95nt、-85 nt、-58 nt、-52 nt、-25nt、-22 nt及-19 nt,其中NM_032316的TSS位于ATG上游-85 nt處、AF538150和AK094248的TSS位于-25 nt處。證實(shí)AF538150不存在第2外顯子中6核苷酸序列(5'-TTGCAG-3')的缺失,其CDs為516 bp,編碼一種由171個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(而非GenBank中公布的CDs為510 bp,一種由169個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì))。成功克隆得到一種新的NPCEDRG基因的mRNA剪接變異體V2,其TSS位于-23 nt處,其CDs為297 bp,編碼—種由98個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),其分子量為10.4 kD,等電點(diǎn)為7.1。 [NPCEDRG基因啟動(dòng)子的克隆、鑒定及其調(diào)控元件的初步分析] 依據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果,構(gòu)建一系列5’-或3’-端缺失的啟動(dòng)子片段Luc報(bào)告基因載體。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至MCF7. HeLa和CNE2三種細(xì)胞中,熒光素酶活性分析結(jié)果表明NPCEDRG基因5’-端調(diào)控區(qū)-1180～-8 bp區(qū)間各Luc報(bào)告基因質(zhì)粒均有較強(qiáng)啟動(dòng)子活性,其中pGL3-en617的熒光素酶活性最強(qiáng),約為pGL-contral的33.46-52.34%,提示-625～-8 bp區(qū)間為最佳的啟動(dòng)子區(qū)域；pGL3-en138的熒光素酶活性約為pGL-contral的15.80-21.12%,表明-146～-8 bp區(qū)間為NPCEDRG基因的基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)域。在-1180～-8 bp區(qū)間相鄰各區(qū)段啟動(dòng)子活性比較發(fā)現(xiàn),pGL3-en207與pGL3-en617比較啟動(dòng)子活性降幅最大,在三種細(xì)胞中分別達(dá)到40-45%,因此,我們推測在NPCEDRG基因5’-端調(diào)控區(qū)-625～-216 bp區(qū)間可能存在增強(qiáng)其啟動(dòng)子活性的調(diào)控元件 進(jìn)一步構(gòu)建pEGFP-en617. pEGFP-en207及PEGFP-en138等啟動(dòng)子區(qū)EGFP報(bào)告基因載體并轉(zhuǎn)染至MCF7細(xì)胞中,熒光顯微鏡直接觀察及Western Blot檢測EGFP蛋白表達(dá),與Luc報(bào)告基因載體熒光素酶活性測定結(jié)果基本吻合,再次確證NPCEDRG基因5’-端調(diào)控區(qū)-625～-8 bp區(qū)間為NPCEDRG基因的最佳啟動(dòng)子區(qū),-146～-8 bp區(qū)間為其基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)。 生物信息學(xué)分析結(jié)果提示NPCEDRG基因啟動(dòng)子為不含TATA,含有CCAAT盒及GC富集區(qū),可能存在CCAAT/NFY, STAT1和SPl等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。凝膠電泳遷移率阻滯分析(EMSA)初步確定CCAAT/NF-Y轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)參與了NPCEDRG基因的表達(dá)調(diào)控。
[Abstract]:Nasopharyngeal carcinoma ( NPC ) is an epithelial origin head and neck malignant tumor characterized by obvious racial and regional distribution . The etiology of nasopharyngeal carcinoma is related to genetic factors , infection of Epstein - Barr virus , diet and chemical carcinogen in certain environment .


NPCEDRG ( NPCEDRG ) gene is a candidate for NPC cell line and nasopharyngeal carcinoma ( NPC ) . The NPCEDRG gene is downregulated in some nasopharyngeal carcinoma cell lines and nasopharyngeal carcinoma tissues . The NPCEDRG gene can inhibit the proliferation and cell cycle progression of nasopharyngeal carcinoma cells and partially reverse the malignant phenotype of CNE2 , suggesting that the NPCEDRG gene may be a candidate tumor suppressor gene for NPC .


In order to reveal the molecular mechanism of the down - regulation of NPCEDRG gene in nasopharyngeal carcinoma cells and tissues , the biological function of NPCEDRG gene was discussed in detail . The candidate tumor suppressor gene NPCEDRG gene was comprehensively analyzed by bioinformatics , and its 5 ' - end promoter region was successfully cloned by using bioinformatics prediction of promoter region and transcription factor binding site of NPCEDRG gene .


Analysis of Structure and Homology of NPCEDRG


Human NPCEDRG gene was located in 3p31 - 21.2 region of the genetic susceptibility region of familial nasopharyngeal carcinoma in Hunan . At least 9 mRNA splice variants were formed by splicing methods . At least three different proteins were encoded . The results showed that the NPCEDRG gene was highly homologous to five kinds of animals , such as chimp , rhesus monkey , dog , cattle and mouse , and showed that the NPCEDRG gene was a relatively conservative gene .


Predicting NPCEDRG gene expression regulatory elements by bioinformatics


There are two CpG islands in the region of -1573 锝，

本文編號(hào)：1808474