本文選題：近視 + 透鏡誘導　； 參考：《鄭州大學》2011年博士論文

【摘要】：近視是眼科的常見病、多發(fā)病,影響患者的學習、工作和生活,其發(fā)病率逐年上升,已經成為嚴重的醫(yī)學社會問題。因此,近視的發(fā)病機制及其防治已成為全球關注的熱點。 隨著分子生物學技術的發(fā)展,大量研究提示：異常視覺信息引起眼內多種生長因子及神經遞質發(fā)生改變,通過一系列的信號轉導過程,導致鞏膜細胞外基質(extracellular matrix, ECM)過多降解,鞏膜重塑,眼軸延長,形成近視。研究證實,近視形成過程中,鞏膜基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)表達明顯增強。MMP-2是降解鞏膜ECM最主要的酶,MMP-2表達增高極可能是近視眼中鞏膜重塑的直接原因。但MMP-2表達增高的具體原因尚不清楚。 肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一種多功能的生長因子,其受體c-Met由原癌基因c-met編碼,具有酪氨酸激酶活性。HGF及其受體c-Met存在于多種組織和細胞中。HGF與其受體c-Met結合后,可激活c-Met發(fā)生自體磷酸化,啟動下游信號轉導通路的級聯(lián)激活,從而調節(jié)多種組織器官的生長發(fā)育及多種病理過程。近年來大量研究顯示,HGF可在多種組織及細胞上調MMP-2的表達,導致ECM降解,發(fā)揮其抗纖維化的作用。最近,在小鼠眼球生長基因研究中發(fā)現(xiàn),HGF相關基因可能與眼球生長密切相關。而眼球的生長與近視形成有密切的關系,因此我們推測：HGF可能與近視的形成有關。 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)家族是1990年被發(fā)現(xiàn)的促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase, MAPK)超家族成員之一,是成纖維細胞等細胞中多種信號從細胞表面向核內傳遞的共同途徑,屬于進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。以JNK為中心的JNK信號轉導通路可被生長因子、細胞因子及環(huán)境應激等刺激信號激活,從而調控下游基因的轉錄,在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。最近研究顯示,JNK信號轉導通路可介導多種組織及細胞內MMP-2的表達增強,促進ECM降解,發(fā)揮抗纖維化等作用。 鞏膜組織及細胞中有否HGF及c-Met的表達?近視眼鞏膜中HGF及c-Met表達是否增強?HGF能否上調鞏膜中MMP-2的表達?如果能,是通過JNK信號轉導通路的介導嗎?目前國內外文獻中尚未見相關報道。 研究建立豚鼠透鏡誘導性近視模型,培養(yǎng)豚鼠鞏膜成纖維細胞,檢測近視形成過程中HGF及MMP-2的表達變化；在體外培養(yǎng)的豚鼠鞏膜成纖維細胞中，，觀察HGF能否上調MMP-2的表達及JNK信號轉導通路在HGF上調MMP-2表達中的作用；玻璃體腔注射JNK信號轉導通路的特異性抑制劑SP600125,觀察其是否能抑制豚鼠透鏡誘導性近視的形成,從而探討HGF-JNK-MMP-2信號途徑在近視形成中的作用,為近視的防治提供新的思路。課題分以下3部分。 第一部分肝細胞生長因子在豚鼠透鏡誘導性近視眼的表達 目的 建立豚鼠透鏡誘導性近視模型,應用免疫組織化學、Western blot及RT-PCR方法檢測正常對照組及透鏡誘導組鞏膜中HGF、c-Met及MMP-2的mRNA及蛋白表達,以探討HGF與近視形成的關系。 方法 1.動物模型的建立及分組：選用健康1周齡雄性花色豚鼠90只,隨機分為正常對照組和透鏡誘導組。對照組：30只豚鼠的雙眼不作任何處理,共60眼。透鏡誘導組：60只豚鼠的右眼,眼前配戴-10.0D透鏡,共60眼。6周后,每組取20眼用于HE染色及免疫組化檢測,20眼用于RT-PCR檢測,另20眼用于Western blot方法檢測。 2.屈光度與眼軸長度測量：實驗前后以檢影鏡檢測豚鼠屈光狀態(tài),眼科A超測量眼軸長度。 3. HE染色與形態(tài)學觀察：光學顯微鏡下觀察正常對照組及透鏡誘導組的形態(tài)學變化。 4.免疫組化染色方法：檢測正常對照組及透鏡誘導組鞏膜中HGF、c-Met及MMP-2的蛋白表達。 5.RT-PCR方法：檢測正常對照組及透鏡誘導組鞏膜中HGF、c-Met及MMP-2的mRNA表達。 6. Western blot方法：檢測正常對照組及透鏡誘導組鞏膜中HGF、c-Met、p-c-Met及MMP-2的蛋白表達。 7.統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)均用x±s表示,統(tǒng)計學處理應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,2組間比較采用配對t檢驗,眼軸長度與屈光度關系采用直線相關分析,取α=0.05作為檢驗水準。 結果 1.屈光度與眼軸長度：與正常對照組比較,透鏡誘導組形成了明顯近視：負屈光度明顯增加(P＜0.05),眼軸明顯增長(P＜0.05)。 2.形態(tài)學變化：透鏡誘導組視網膜、脈絡膜及鞏膜均變薄,鞏膜膠原纖維變薄、排列稀疏、紊亂。 3.免疫組化染色檢測：正常對照組鞏膜中可檢測到HGF、c-Met及MMP-2蛋白呈低水平表達,鞏膜輕度著染呈淡黃色；透鏡誘導組鞏膜中HGF、MMP-2蛋白表達較正常對照組明顯增強(P＜0.05),鞏膜組織著色呈棕黃色,2組中c-Met蛋白表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4. RT-PCR方法檢測：正常對照組鞏膜中可檢測到HGF、c-Met及MMP-2mRNA低水平表達；透鏡誘導組鞏膜中HGF及MMP-2 mRNA表達較正常對照組明顯增強(P＜0.05),而c-Met mRNA表達在2組中比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 5. Western blot方法檢測：正常對照組鞏膜中可檢測到HGF、c-Met及MMP-2蛋白低水平表達,透鏡誘導組鞏膜中HGF、MMP-2蛋白表達較正常對照組明顯增強(P＜0.05)。2組中總的c-Met蛋白表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但在透鏡誘導組中p-c-Met蛋白表達明顯增強(P＜0.05)。 6. HGF. p-c-Met及MMP-2蛋白在透鏡誘導組鞏膜中表達的相關性分析：在透鏡誘導組鞏膜中,HGF與p-c-Met, p-c-Met與MMP-2及HGF與MMP-2蛋白表達的相關系數(shù)分別是0.902,0.885,0.900,P均＜0.05,提示三者的蛋白表達兩兩相關。 結論 1.透鏡誘導組鞏膜中,HGF表達增加,其受體c-Met磷酸化增強,提示：HGF可能參與透鏡誘導性近視的形成。 2.透鏡誘導組鞏膜中,HGF、p-c-Met及MMP-2的蛋白表達增強且兩兩正相關,提示：HGF可能通過上調MMP-2的表達參與透鏡誘導性近視形成。 第二部分HGF調控豚鼠鞏膜成纖維細胞MMP-2表達的體外研究 目的 實驗前期研究發(fā)現(xiàn),HGF可能通過上調MMP-2表達參與透鏡誘導性近視的形成和發(fā)展。進一步培養(yǎng)正常對照組及透鏡誘導組豚鼠鞏膜成纖維細胞,在體外檢測2組細胞中HGF、c-Met及MMP-2蛋白表達；用HGF及其siRNA處理鞏膜成纖維細胞,檢測MMP-2的mRNA及蛋白表達；并觀察JNK信號轉導通路在HGF調控MMP-2表達中的作用。從而探討HGF-JNK-MMP-2信號途徑在近視形成中的作用。 方法 1.培養(yǎng)正常對照組和透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞：將30只1周齡雄性花色豚鼠隨機分為正常對照組和透鏡誘導組。對照組：10只豚鼠的雙眼不作任何處理,共20眼。透鏡誘導組：20只豚鼠的右眼,眼前配戴-10.OD透鏡,共20眼。4周后,處死豚鼠,體外培養(yǎng)正常對照組和透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞,觀察細胞形態(tài),并鑒定細胞類型。 2.免疫細胞化學染色方法及Western blot方法檢測正常對照組和透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中HGF、c-Met及MMP-2的蛋白表達。 3.探討在體外培養(yǎng)的豚鼠鞏膜成纖維細胞中,MMP-2是否為HGF的直接靶基因： 3.1 MTT法檢測不同濃度(0.1 ng/ml、1ng/ml、10ng/ml)的HGF對正常對照組鞏膜成纖維細胞增殖的影響。 3.2上述不同濃度的HGF作用于正常對照組鞏膜成纖維細胞,Western blot方法檢測細胞中p-c-Met的蛋白表達,RT-PCR及Western blot方法檢測MMP-2的mRNA及蛋白表達。選取不明顯影響鞏膜成纖維細胞增殖、上調MMP-2表達作用明顯的HGF的濃度為10ng/ml,用于后續(xù)實驗。 3.3鑒于透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中內源性HGF基因表達較高,我們選擇其用于HGFsiRNA轉染。在透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中轉染HGF siRNA, Western blot方法檢測HGF蛋白表達,RT-PCR及Western blot方法檢測MMP-2 mRNA及蛋白表達。 4.探討在體外培養(yǎng)豚鼠鞏膜成纖維細胞中,HGF上調MMP-2的表達是否通過JNK信號轉導通路介導： 4.1 HGF (10ng/ml)作用于正常對照組鞏膜成纖維細胞,Western blot方法檢測JNK信號轉導通路的狀態(tài)及MMP-2蛋白表達的變化。 4.2 MTT法檢測不同濃度(0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)的SP600125對正常對照組鞏膜成纖維細胞增殖的影響,選取10μmol/L為最佳濃度,用于后續(xù)實驗。 4.3 SP600125 (10μmol/L)預處理后,HGF(10ng/ml)作用于正常對照組鞏膜成纖維細胞,Western blot方法檢測JNK信號轉導通路的狀態(tài)及MMP-2蛋白表達的變化。 5.統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)均用x±s表示,統(tǒng)計學處理應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,2組間比較采用配對t檢驗,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗,取α=0.05作為檢驗水準。 結果 1.培養(yǎng)的正常對照組和透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞生長良好,光鏡下觀察形態(tài)差異不明顯。2組細胞均表達波形蛋白,而不表達角蛋白,表明所培養(yǎng)細胞確實為成纖維細胞。 2. 2組鞏膜成纖維細胞中HGF、c-Met及MMP-2的蛋白表達： 2.1免疫細胞化學染色方法：正常對照組鞏膜成纖維細胞中可檢測到HGF、c-Met及MMP-2蛋白低水平表達,胞漿呈淡黃色著色；透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中HGF、MMP-2蛋白表達較正常對照組明顯增強(P＜0.05),胞漿呈棕黃色著色,2組細胞總c-Met蛋白表達Mol/L(P＞0.05)。 2.2 Western blot方法檢測：正常對照組鞏膜成纖維細胞中可檢測到HGF、c-Met及MMP-2蛋白低水平表達；透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中HGF、MMP-2蛋白表達較正常對照組明顯增強(P＜0.05)；2組細胞總c-Met蛋白表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中c-Met蛋白磷酸化明顯增強(P＜0.05)。 3.在體外培養(yǎng)的豚鼠鞏膜成纖維細胞中： 3.1不同濃度的HGF(0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml)對正常對照組鞏膜成纖維細胞干預72h后未見促進或抑制增殖能力的作用,與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05) 3.2在正常對照組鞏膜成纖維細胞中,HGF以劑量依賴的方式上調p-c-Met蛋白表達,隨后以劑量依賴的方式上調MMP-2的mRNA及蛋白表達,各組間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05) 3.3在透鏡誘導組鞏膜成纖維細胞中轉染HGF siRNA, HGF siRNA以時間依賴的方式抑制HGF蛋白表達,與空白對照組比較,72h后HGF蛋白表達明顯下降(P＜0.05),同時MMP-2的mRNA及蛋白表達也明顯下降(P＜0.05) 4.在體外培養(yǎng)的豚鼠正常對照組鞏膜成纖維細胞中： 4.1 HGF (10ng/ml)可以激活細胞中JNK信號轉導通路,誘導JNK磷酸化增強,繼而引起MMP-2蛋白表達明顯上調(P＜0.05)。 4.2不同濃度的SP600125干預細胞72h后,未表現(xiàn)出明顯促進或抑制增殖能力的作用,與空白對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 4.3用SP600125(10μmol/L)預處理細胞后,HGF(10ng/ml)作用引起的JNK磷酸化和MMP-2蛋白表達上調均被明顯抑制(P＜0.05)。 結論 1.透鏡誘導導致豚鼠鞏膜成纖維細胞內新的HGF蛋白合成以及MMP-2蛋白表達上調。 2.在體外培養(yǎng)的豚鼠鞏膜成纖維細胞中,HGF上調MMP-2的表達。 3.在體外培養(yǎng)的豚鼠鞏膜成纖維細胞中,HGF上調MMP-2的表達是通過JNK信號轉導通路來實現(xiàn)的。提示,HGF可能通過HGF-JNK-MMP-2信號途徑參與豚鼠透鏡誘導性近視形成。 第三部分：SP600125阻斷豚鼠透鏡誘導性近視鞏膜中JNK信號轉導通路的研究 目的 為了進一步在體內探討近視鞏膜中SP600125對JNK信號轉導通路及近視形成的抑制作用,研究首先建立豚鼠透鏡誘導性近視模型,采用玻璃體腔注射給藥的方式,進一步明確JNK信號轉導通路在近視形成中的作用及SP600125對近視的抑制作用。 方法 1.動物模型的建立與分組：選用健康1周齡雄性花色豚鼠70只,隨機分成4組：Ⅰ組(透鏡誘導6周組)、Ⅱ組.(透鏡誘導6周+PBS組)、Ⅲ組(透鏡誘導6周+SP600125(10μmol/L)組)、Ⅳ組(正常對照組)。正常對照組10只豚鼠,取雙眼20眼為實驗眼；余每組20只豚鼠,均以右眼為實驗眼。 2.屈光度及眼軸長度測量：同第1部分 3. HE染色與形態(tài)學觀察：同第2部分 4. Western blot方法：檢測各組豚鼠鞏膜組織中p-JNK和MMP-2的蛋白表達。 5.統(tǒng)計學分析：同第1部分 結果 1.屈光度及眼軸長度：Ⅰ組形成明顯的高度近視,負屈光度及眼軸長度均較Ⅳ組明顯增加(P均＜0.05),Ⅲ組能部分抑制上述改變,而Ⅱ組則無明顯抑制作用。表明,SP600125(10μmol/L)部分抑制異常視覺信號引起的近視形成。 2. HE染色與形態(tài)學觀察：Ⅰ組與Ⅳ組比較,后極部鞏膜明顯變薄,Ⅲ組能部分抑制上述鞏膜的改變,而Ⅱ組則無明顯抑制作用。 3. Western blot方法檢測：Ⅰ組鞏膜組織p-JNK及MMP-2的蛋白表達較Ⅳ組明顯增強(P＜0.05),Ⅲ組能部分抑制上述改變,而Ⅱ組則無明顯抑制作用。表明,SP600125部分抑制了異常視覺信號引起的p-JNK及MMP-2的蛋白表達。 結論 JNK信號轉導通路的抑制劑SP600125可能具有抑制近視的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R778.11

【參考文獻】

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本文編號：1787968