本文選題：骨橋蛋白 + 人Tenon’s囊成纖維細(xì)胞��； 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究目的 骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）是功能復(fù)雜的磷酸化糖蛋白，可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖、新生血管形成，是調(diào)控瘢痕形成的重要因子。本研究探討OPN對人Tenon’s囊成纖維細(xì)胞（human tenon’s fibroblasts，HTFs）的調(diào)控作用及在抗青光眼手術(shù)條件下對手術(shù)區(qū)域局部瘢痕形成的影響，對其發(fā)揮生物學(xué)作用的機(jī)制進(jìn)行研究，以拓展對青光眼手術(shù)瘢痕形成機(jī)制的認(rèn)識，并評價自主研制的OPN單克隆抗體1A12是否能抑制青光眼手術(shù)后瘢痕的形成，為預(yù)防青光眼術(shù)后瘢痕形成提供新的思路。 研究方法 1、OPN在HTFs中的作用及機(jī)制探討（體外實驗） 不同濃度（0，0.05μM，0.5μM和5μM）的OPN，，OPN聯(lián)合1A12（5μMOPN+20μg/ml1A12）對HTFs進(jìn)行處理，采用MTT法檢測HTFs的增殖速度，并采用細(xì)胞劃痕法檢測HTFs的移行速度。不同濃度（0，0.05μM，0.5μM和5μM）的OPN，OPN聯(lián)合MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路抑制劑PD98059、LY294002（5μM+10μM+30μM），OPN聯(lián)合1A12（5μM OPN+20μg/ml1A12）對HTFs進(jìn)行處理，采用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測HTFs中的VEGF和TGF-β的mRNA水平變化，并采用Western blotting檢測HTFs中的I型膠原蛋白以及信號傳導(dǎo)通路上的p-ERK、p-AKT、p-IKKα和p-NFκB的蛋白表達(dá)，探討OPN調(diào)控HTFs增殖移行的信號傳導(dǎo)通路機(jī)制。 2、OPN在兔眼抗青光眼手術(shù)區(qū)域的作用及機(jī)制探討（動物實驗） 建立抗青光眼手術(shù)兔眼模型，隨機(jī)分為四組，A組為NS組，術(shù)中，術(shù)后第1，2，7d結(jié)膜下注射0.1ml NS；B組為MMC組，術(shù)中在Tenon’s囊放置0.4mg/ml MMC棉球5分鐘，術(shù)后第1，2，7d結(jié)膜下注射0.1ml NS；C組為OPN組，術(shù)中，術(shù)后第1，2，7d結(jié)膜下注射0.1ml（2.5μg）OPN；D組為1A12組，術(shù)中，術(shù)后第1，2，7d結(jié)膜下注射0.1ml（10μg）1A12。觀察兔眼抗青光眼手術(shù)區(qū)域的濾過泡形態(tài)、濾過泡相對面積和高度，以及眼壓的動態(tài)變化。對四組手術(shù)區(qū)域進(jìn)行切片和病理學(xué)觀察，包括HE染色，馬森三色染色，網(wǎng)狀纖維染色，α-平滑肌肌動蛋白染色（α-SMA）和Ki67染色。Real-time PCR方法檢測四組不同時間點(diǎn)手術(shù)區(qū)域組織中OPN、VEGF、TGF-β和I型膠原蛋白的mRNA水平變化。Western blotting檢測四組不同時間點(diǎn)手術(shù)區(qū)域組織中I型膠原蛋白、p-ERK和p-AKT的蛋白表達(dá)。 結(jié)果 1、OPN促進(jìn)體外培養(yǎng)的HTFs增殖和移行，該效應(yīng)可以被1A12抑制。OPN處理組的HTFs增殖能力增強(qiáng)，移行速度加快，而且隨著OPN的濃度增加（0，0.05μM，0.5μM和5μM）而增加。給予1A12（5μM OPN+20μg/ml1A12）處理后HTFs增殖和移行速度變慢。 HTFs的VEGF和TGF-β的mRNA含量均為微量，不同濃度的OPN處理后VEGF和TGF-β的mRNA表達(dá)水平變化無統(tǒng)計學(xué)意義。OPN處理后HTFs中I型膠原蛋白的蛋白表達(dá)上調(diào)，并且呈濃度依賴性（0，0.05μM，0.5μM和5μM）。該作用既可以被MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路抑制劑PD98059、LY294002抑制，也可以被OPN抗體1A12抑制。隨著OPN濃度的增加，p-ERK、p-AKT的蛋白表達(dá)也隨之上調(diào)，該作用同樣可以被PD98059或LY294002抑制，也可以被1A12抑制。p-IKKα和p-NFκB的蛋白表達(dá)不隨OPN濃度變化而變化，也不被1A12所抑制。 2、OPN促進(jìn)兔眼抗青光眼手術(shù)區(qū)域瘢痕化，該效應(yīng)可以被1A12抑制。 四組抗青光眼手術(shù)兔眼模型，術(shù)后濾過泡相對面積和高度縮小所需的時間：OPN組最短，其次是NS組，MMC組和1A12組最長，MMC組與1A12組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。濾過泡壁1A12組相對較厚，接近正常結(jié)膜組織，而MMC組濾過泡蒼白、菲薄，呈囊狀。四組不同時間點(diǎn)的眼壓比較：術(shù)前、術(shù)后第1d、3d和5d差異無統(tǒng)計學(xué)意義，術(shù)后第7d時OPN組高于其他三組，術(shù)后14d和21d時NS組與OPN組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，兩組均高于MMC組和1A12組，術(shù)后28d時四組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 病理學(xué)觀察：抗青光眼手術(shù)區(qū)域組織的馬森三色染色和網(wǎng)狀纖維染色顯示OPN組鞏膜膠原纖維比其他三組更加致密。α-SMA染色陽性分值OPN高于MMC組和1A12組，與NS組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)膜及結(jié)膜下Ki67染色，鞏膜瓣切口周圍Ki67染色陽性分值OPN組高于其他三組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 手術(shù)區(qū)域VEGF和TGF-β的mRNA含量均為微量，同一時間點(diǎn)四組VEGF和TGF-β的mRNA含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與NS組相比，手術(shù)區(qū)域中I型膠原蛋白的mRNA和蛋白的表達(dá)，OPN組上調(diào)，MMC組和1A12組下調(diào)，該效應(yīng)在術(shù)后早期（第3d）尤其明顯。與NS組相比，手術(shù)區(qū)域的p-ERK、p-AKT的蛋白表達(dá)，OPN組上調(diào)，MMC組和1A12組下調(diào)，與細(xì)胞實驗的結(jié)果相符。 結(jié)論 OPN促進(jìn)HTFs的增殖和移行，呈濃度依賴性，該效應(yīng)可被OPN單克隆抗體1A12所抑制。OPN與MAPK/ERK和PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路關(guān)系密切，上調(diào)OPN可以激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路，從而誘導(dǎo)這兩條信號傳導(dǎo)通路下游的分子細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。OPN通過激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)HTFs中I型膠原蛋白的表達(dá)，其抗體1A12可以抑制這種效應(yīng)。OPN上調(diào)抗青光眼術(shù)后濾過泡區(qū)域I型膠原蛋白的表達(dá)，在此過程中激活MAPK/ERK和PI3K/AKT相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，1A12可以抑制這種效應(yīng)。OPN加重青光眼術(shù)后瘢痕化，1A12抑制青光眼術(shù)后瘢痕化。本研究提出應(yīng)用自主研制的OPN單克隆抗體1A12抑制青光眼術(shù)后瘢痕形成的新思路，為將1A12應(yīng)用于抗青光眼手術(shù)以減輕術(shù)后濾過道瘢痕化的臨床研究奠定了實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:Purpose of study

Osteogenic ( osteolytic ) is a complex functional phosphorylated glycoprotein , which can induce the proliferation of fibroblasts and the formation of neovascularization , which is an important factor for the regulation of scar formation . This study explored the mechanism of promoting the formation of scar formation in glaucoma surgery under the condition of anti - glaucoma surgery , and evaluated whether the self - developed anti - scar formation mechanism of the monoclonal antibody 1A12 can inhibit the formation of scar after glaucoma surgery , and provide a new idea for preventing scar formation after glaucoma .

Research Methods

Study on the Role and Mechanism of 1 , 2 in HTFs ( In Vitro Experiment )

The expression of VEGF and TGF - 尾 mRNA in HTFs was detected by MTT assay , and the expression of p - ERK , p - ERK , p - IKK偽 and p - NF - 魏B in HTFs was detected by real - time fluorescence quantitative PCR ( Real - time PCR ) .

Study on the role and mechanism of 2 銆

本文編號：1734705