發(fā)布時(shí)間：2018-03-31 21:14

  本文選題：干細(xì)胞　切入點(diǎn)：腺病毒科　出處：《中國(guó)組織工程研究》2015年41期

【摘要】：背景:研究表明,神經(jīng)母細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)移因子(ASCL1)是神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子,因此通過(guò)對(duì)成體細(xì)胞進(jìn)行ASCL1基因修飾,有可能將成體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)細(xì)胞,為視神經(jīng)再生治療提供新策略。目的:構(gòu)建攜帶鼠ASCL1基因的重組腺病毒表達(dá)載體,獲得重組腺病毒pA d-rat-ASCL1-EGFP,以期為進(jìn)一步研究ASCL1基因的功能奠定基礎(chǔ)。方法:用XhoⅠ和EcoRⅠ將目的基因ASCL1及帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白表達(dá)盒的腺病毒穿梭載體p Yr-adshuttle-4進(jìn)行雙酶切;回收酶切質(zhì)粒的目的片段進(jìn)行連接,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài);提取質(zhì)粒酶切鑒定正確后測(cè)序。然后通過(guò)LR體外同源重組將rat-ASCL1表達(dá)框構(gòu)建至pA d/PL-DEST腺病毒表達(dá)載體,PacⅠ酶切線性化后用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝、擴(kuò)增,采用PCR法對(duì)重組腺病毒進(jìn)行鑒定,TCID50法測(cè)定病毒滴度,熒光顯微鏡觀察病毒感染效率。結(jié)果與結(jié)論:通過(guò)酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定,證實(shí)重組腺病毒載體pA d-rat-ASCL1-EGFP構(gòu)建正確,PCR鑒定擴(kuò)增出862 bp的目的條帶,TCID50法測(cè)定病毒滴度為2×1010pfu/mL。熒光顯微鏡觀察HEK293細(xì)胞的病毒感染效率為80%以上。提示含ASCL1基因的重組腺病毒載體構(gòu)建成功,獲得的病毒具有高滴度,高效感染率,為下一步進(jìn)行ASCL1基因功能研究和視神經(jīng)再生治療研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Background: studies have shown that the neuroblast-specific transfer factor (ASCL1) is a key regulatory factor in the process of neural development. Therefore, by modifying adult cells with ASCL1 gene, it is possible to transform adult cells into neural cells. Objective: to construct a recombinant adenovirus expression vector carrying mouse ASCL1 gene. The recombinant adenovirus pAd-rat-ASCL1-EGFP1 was obtained in order to lay a foundation for further study on the function of ASCL1 gene. Methods: the target gene ASCL1 and the adenovirus shuttle vector p Yr-adshuttle-4 with enhanced green fluorescent protein expression cassette were digested by Xho 鈪，

本文編號(hào)：1692470