發(fā)布時間：2018-03-28 13:31

  本文選題：臍帶間充質(zhì)干細胞　切入點：N-甲基-N-亞硝基脲　出處：《武漢大學》2011年博士論文

【摘要】：研究背景視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)是臨床上一類廣為人知的疾病,1857年由德國科學家Franz Donders發(fā)現(xiàn)并命名。其臨床特征是早期夜盲、雙側(cè)、進展性、非炎癥性視網(wǎng)膜色素的變性。視桿視錐細胞丟失以后,視網(wǎng)膜血管周圍的色素沉積相繼發(fā)生。因此,“視網(wǎng)膜炎”這個詞其實是個誤稱,因為視網(wǎng)膜的炎癥并沒有在疾病的進程中扮演重要作用。RP是一種異質(zhì)性遺傳性視網(wǎng)膜疾病,在視桿細胞變性的過程中,有160多種蛋白質(zhì)基因密碼發(fā)生了變異。典型的眼底圖片呈現(xiàn)出視網(wǎng)膜內(nèi)色素沉積,特別是視網(wǎng)膜血管周圍視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium, RPE)遷移和沉淀造成的骨細胞樣色素沉積。到目前為止,尚沒有有效的治療方法。 間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是具有自我更新和多向分化潛能的一類成體干細胞。來源廣泛,具有支持造血和多向分化的功能；最近,有研究報道從臍帶靜脈和臍帶間質(zhì)(Wharton膠)中成功地分離獲得并建立了穩(wěn)定的間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)體系。研究發(fā)現(xiàn),人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)具有跨系統(tǒng)、跨胚層分化的潛能,在不同誘導劑作用下,可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞及神經(jīng)元等多種中胚層、外胚層來源的細胞。Raymond將臍帶、胎盤、骨髓來源的MSCs以及皮膚成纖維細胞移植到RCS (Royal college of surgeons,RCS)鼠視網(wǎng)膜下腔后,對保留感光細胞的完整性及視功能的有效性進行了比較。研究發(fā)現(xiàn),移植細胞能與宿主視網(wǎng)膜整合,hUC-MSCs和骨髓MSCs都能極大地減輕視功能損害的程度,但iUC-MSCs能大面積的挽救感光細胞,而骨髓MSCs只能在局部發(fā)揮作用。hUC-MSCs被證實能群體倍增并無染色體組核型的改變,為視網(wǎng)膜退行性變?nèi)鏡P提供了一種有效的細胞來源。 目前,國內(nèi)外還沒有關(guān)于臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)在體內(nèi)外分化為感光細胞和在治療感光細胞變性疾病方面的報道。因此hUC-MSCs能否誘導轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元樣細胞并修復視網(wǎng)膜損傷,非常值得我們?nèi)ヌ剿餮芯俊?目的探索體外誘導hUC-MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化的可行性,觀察不同濃度全反式視黃酸(All-trans retinoic acid, ATRA)在誘導hUC-MSCs向神經(jīng)元分化中對細胞形態(tài)、增殖和凋亡的作用并篩選其最適濃度；建立感光細胞缺失模型,探討獲得的hUC-MSCs移植后在大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)存活、分布和分化情況以及rhodopsin和recoverin的表達,為hUC-MSCs在視網(wǎng)膜退行性變領域的臨床應用提供理論依據(jù)和實驗基礎。 方法取足月妊娠剖宮產(chǎn)新生兒的臍帶,利用酶消化法和貼壁法獲得原代細胞,傳至第三代備用。取生長良好的第3代臍帶MSC接種于24孔培養(yǎng)板,細胞貼壁后培養(yǎng)基更換為含ATRA的DMEM/F-12培養(yǎng)液。ATRA終濃度分別為0μmol/L(對照組,A組)、0.25μmol/L(B組)、0.5μmol/L(C組)、1.0μmol/L(D組)、2.0μmol/L(E組)、4.0μmol/L(F組),誘導后1 h、24 h觀察細胞形態(tài),并應用MTT法監(jiān)測ATRA的細胞毒性。另取對照組和經(jīng)各濃度ATRA誘導24 h后的細胞應用AnnexinV/PI聯(lián)合流式細胞儀檢測凋亡細胞百分率和雙標染色后的細胞著色情況,綜合上述指標確定ATRA誘導hUC-MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化的最適濃度。此外,為了進一步研究hUC-MSCs的治療潛能,我們將其移植到MNU誘導的感光細胞缺失SD (Sprague-Dawley)大鼠玻璃體腔,觀察其對受損視網(wǎng)膜的修復情況。建模12h后,將hUC-MSCs 3～5μl移植到玻璃體腔,移植后3d和7d,通過病理組織切片測量視網(wǎng)膜全層及外核層厚度,TUNEL法檢測凋亡細胞形態(tài)和百分比,透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)變化,熒光免疫組化和蛋白免疫印跡觀察rhodopsin和recoverin在視網(wǎng)膜內(nèi)的表達情況。 結(jié)果 1. ATRA (0.25μmol/L、0.5μmol/L)對MSC形態(tài)、細胞增殖、細胞凋亡均無明顯影響(t=0.72,1.32：P0.05)；高濃度(4.0μmol/L)加入后即刻可見部分細胞浮起,24 h后無貼壁細胞；≥1.0μmol/L ATRA誘導24 h后能極顯著抑制細胞增殖(t=8.8,18.9,22.1；P0.01),且隨ATRA濃度增加,抑制作用越明顯。誘導24 h后,2.0μmol/L組細胞回縮較1h更明顯,大部分細胞由長梭形回縮至類圓形,細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)粗大顆粒,部分細胞漂�。�1.0μmol/L組中僅有少數(shù)細胞有形態(tài)改變；Annexin V/PI聯(lián)合FCM檢測顯示≥1.0μmol/L組細胞凋亡率與對照組間差異有統(tǒng)計學意義(t=9.88,19.95,31.61；P0.01)。 2. 60mg/kg MNU可選擇性的誘導感光細胞缺失,MNU注射12h后,外核層(outer nuclear layer, ONL)和外節(jié)層(outer segment, OS)細胞間隙擴張呈空泡樣。MNU注射1d后,感光細胞核固縮、破裂,ONL和OS層厚度輕微變薄,電鏡下可觀察到凋亡小體,周圍的細胞出現(xiàn)空泡。這種變化在MNU注射7d后十分明顯。但整個過程中,內(nèi)核層(inner nuclear layer, INL)及節(jié)細胞層(ganglionic layer)的厚度,細胞形態(tài)數(shù)量沒有發(fā)生明顯改變。 3. hUC-MSCs移植后能延緩感光細胞的變性,移植細胞在SD大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)存活細胞數(shù)顯著多于正常對照組大鼠視網(wǎng)膜,大部分細胞遷移至宿主視網(wǎng)膜外核層。移植后視網(wǎng)膜內(nèi)recoverin和(?)rhodopsin的mRNA表達上調(diào),在移植3d后差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論 1.建立了高純度、生物學特性良好的hUC-MSCs培養(yǎng)體系,擴展了hUC-MSCs在研科技處研究中的應用范圍。0.5μmol/L ATRA是誘導臍帶MSC向神經(jīng)元樣細胞轉(zhuǎn)化的最佳劑量,≥1.0μmol/L能明顯抑制MSC的增殖,增加細胞凋亡率并誘導細胞發(fā)生明顯損傷。 2.一次性腹腔注射60mg/kg MNU可選擇性導致感光細胞凋亡,并持續(xù)作用7d。MNU是一種廣泛分布于環(huán)境中的強烷化劑,注射后大鼠感光細胞核上可見甲基化DNA嵌合物形成。因此,MNU是有效誘導視網(wǎng)膜變性的一個不錯選擇。 3. hUC-MSCs通過上調(diào)recoverin和(?)rhodopsin的mRNA表達來挽救MNU誘導的感光細胞凋亡。這提示我們,hUC-MSCs在促進損傷視網(wǎng)膜恢復的過程中發(fā)揮了重要作用,為未來MSCs用于臨床治療、使患者盡可能短時間內(nèi)獲得有效治療及重建視功能提供了一種新的思考方向。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R774.1

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