本文選題：阻塞性　切入點(diǎn)：睡眠呼吸暫停　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的和意義:阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAS)人群發(fā)病率較高,潛在危害性大,是近年來多個(gè)學(xué)科的研究熱點(diǎn)。但咽腔塌陷詳盡的病理生理過程仍未闡明,咽腔解剖異常以及上氣道擴(kuò)張肌功能紊亂是兩個(gè)最重要的已知致病因素,而不同個(gè)體的主導(dǎo)致病因素存在差異。這也是部分患者遠(yuǎn)期手術(shù)療效不佳的原因。目前,OSAS解剖因素的研究已較為深入,但對于OSAS患者上氣道擴(kuò)張肌特異性肌肉病理改變的研究不多,而肌肉功能紊亂的機(jī)制探討則更少見。肌肉的形態(tài)學(xué)改變、肌纖維類型、肌球蛋白重鏈組成成分等可以提供肌肉功能損傷的可靠信息。骨骼肌纖維高度分化,在成體仍具有高度可塑性。為了適應(yīng)不同的環(huán)境條件,肌肉會通過改變其纖維類型的組成來實(shí)現(xiàn)其特定的功能特性。而OSAS患者因長期間歇低氧,上氣道擴(kuò)張肌發(fā)生適應(yīng)性病理改變,I型纖維比例下降。同時(shí)我們注意到雌激素(estrogen,ER)與女性阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(OSAS)低發(fā)病率密切相關(guān),大量流行病學(xué)資料已經(jīng)證實(shí),ER在OSAS發(fā)病過程中扮演了保護(hù)性角色,但ER引發(fā)的分子調(diào)控機(jī)制一直未明。鑒于雌激素相關(guān)受體α(estrogen related receptor-α,ERR-α)主要在高代謝需求的組織中表達(dá),并作為轉(zhuǎn)錄因子在肌管的線粒體代謝方面扮演重要角色。因此我們提出假設(shè),ERR-α可能介導(dǎo)OSAS患者上氣道擴(kuò)張肌肌纖維類型轉(zhuǎn)化,進(jìn)而引發(fā)上氣道肌力和咽腔塌陷性的變化,在OSAS的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要角色。本課題擬在完善OSAS患者組織標(biāo)本肌肉病理檢查基礎(chǔ)上,進(jìn)行功能基因預(yù)測。通過雌激素刺激和ERR-α特異性拮抗逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞模型,細(xì)胞間隙低氧,SiRNA干擾試驗(yàn),建立去卵巢動物模型,從體內(nèi)和體外兩方面研究ER/ERR-α軸對OSAS患者上氣道擴(kuò)張肌的影響并探討其分子機(jī)制。本項(xiàng)目通過探討ER/ERR-α軸在OSAS病因中扮演的角色,以新的視角闡述女性O(shè)SAS低發(fā)病率的機(jī)制,為高危女性O(shè)SAS患者的預(yù)防及激素替代治療提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。材料和方法1.臨床標(biāo)本收集選取南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院耳鼻喉科2011年2月至2013年7月的接受外科治療的成人男性O(shè)SAHS患者28例作為研究對象,14例慢性扁桃體炎的非OSAS男性患者作為對照。術(shù)中取材,所有標(biāo)本均為腭咽肌組織,經(jīng)病理學(xué)檢查確診,所有患者既往均無口咽部手術(shù)史、無局部放療史。本研究經(jīng)南方醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書。本研究通過中國臨床試驗(yàn)注冊中心 Chinese ClinicalTrials.gov 審查批準(zhǔn),批準(zhǔn)號 ChiCTR-CCC-13003415,病情分級依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診斷和外科治療指南,根據(jù)多導(dǎo)睡眠監(jiān)測(polysomnography,PSG)結(jié)果進(jìn)行病情判定。2.肌肉病理染色沿肌纖維走行方向?qū)⒓∪饬⒂谲浤救?用黃蓍膠(tragacanth gum)固定。冰凍連續(xù)切片。除了常規(guī)蘇木精-伊紅染色(HE)外,采用3種酶組織化學(xué)染色:還原型輔酶 Ⅰ 四氮唑還原酶(nicotinamide adenine dinucleotide-tetrazolium reductase,NADH-TR)染色,改良 Gomori 三色(modified Gomori trichrome,MGT)染色和肌球蛋白三磷酸腺苷酶(ATP酶)染色。3.細(xì)胞培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞C2C12采用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基,在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng),細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。4.細(xì)胞間隙低氧培養(yǎng)C2C12細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱(Thermo 3111,USA)給予3%間隙低氧培養(yǎng),直接通入N2精確控制CO2和O2濃度,35min低氧,25min常氧,間隙低氧8h/天。常規(guī)培養(yǎng)37℃、5%CO2、飽和濕度的條件做對照。5.細(xì)胞ER刺激C2C12細(xì)胞中,加入不同濃度的細(xì)胞培養(yǎng)用ER,設(shè)立空白對照。加入不同濃度的ERR-α特異性拮抗劑XCT-790,確定最佳阻斷效果。在不同濃度的ER同時(shí)加入最適濃度的ERR-α特異性拮抗劑XCT790,實(shí)現(xiàn)ER作用的逆轉(zhuǎn),證實(shí)ER是通過ERR-α實(shí)現(xiàn)肌型轉(zhuǎn)化。6.瞬時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染ERR-α的SiRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:采用陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,操作按LipofectamineTM 2000試劑說明書進(jìn)行。6孔板中SiRNA的轉(zhuǎn)染量為100nM。7.熒光定量PCR抽提細(xì)胞和組織的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,18s為內(nèi)參照,采用SYBR green法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過相對定量以2-△△Ct值代表基因的相對表達(dá)強(qiáng)度。8.Western blot抽提細(xì)胞總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定,然后10%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交、顯影及定影,蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度采用Quantity One軟件進(jìn)行定量。9.動物實(shí)驗(yàn)取健康雌性SD大鼠假手術(shù)組、去卵巢組各5只。麻醉成功后,行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)。假手術(shù)組處理方法相同,但只切取腹腔少許脂肪組織。頸正中切口,取兩組動物的胸舌骨肌作為自身處理前的對照。2周后,取大鼠胸舌骨肌,組織放入勻漿器中勻漿,qRT-PCR檢測組織中各型型MyHC及及ERR-α含量,方法同前。組織切片免疫組化明確蛋白變化。10.免疫組化將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、抗體孵育、DAB顯色、復(fù)染、透明、封片等步驟進(jìn)行,免疫組化的檢測結(jié)果進(jìn)行半定量判定。免疫組化結(jié)果判斷方法如下:染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)標(biāo)準(zhǔn):無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。同倍物鏡下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù),1～25%為1分,26～50%為2分,51～75%為3分,75%為4分。兩項(xiàng)得分相加,滿3分為"+";4分為"++";5分以上為"+++"。"++～+++"為陽性表達(dá)。11.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)資料,進(jìn)行組內(nèi)正態(tài)分布性檢驗(yàn)(One-SampleKolmogorov-SmirnovTest),組間方差齊性Levene'sTest檢驗(yàn)。多組均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析,多重比較Dunnett檢驗(yàn),其他實(shí)驗(yàn)中涉及到兩組數(shù)據(jù)之間的比較均采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),自身前后對照采用配對T檢驗(yàn)。兩組間病理改變的出現(xiàn)機(jī)率使用Pearson Chi-Square卡方檢驗(yàn),當(dāng)1理論頻數(shù)5,則采用ContinuityConrrection卡方檢驗(yàn)。方差齊性檢驗(yàn)以P0.1為臨界值,其他以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1、肌肉病理染色:OSAS患者存在腭咽肌病理損傷,包括肌纖維內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變化和肌纖維類型分布異常,維持上氣道開放的Ⅰ型肌纖維比率下降。肌纖維分葉狀或蟲蝕狀改變(χ2值19.091,P=0.0000.05)、不整紅邊纖維(χ2值3.977,P=0.0460.05)、群組化分布(χ2值 17.348,P=0.0000.05)是 OSAS 患者較為特征性的改變,兩組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。兩組都可以觀察到核內(nèi)移的現(xiàn)象,為非特異性改變,但在OSAS組比例較高(χ2值3.938,P=0.0470.05)。僅在部分OSAS患者中觀察到,壞死肌纖維、肌內(nèi)膜和肌束膜增生、靶樣纖維,但兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。NADH染色中特征性的環(huán)形外觀、HE染色中肌纖維大小的明顯變異性為兩組較為共性的表現(xiàn)。2、OSAS患者腭咽肌肌型分布及ERR-α表達(dá):組織中ERR-α的平均表達(dá)僅為正常對照15%。兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn),兩組間ERR-α△CT值差異具有顯著性(16.42±3.06 vsl3.62±4.08,t=-2.495,P=0.070.05)。免疫組化染色證實(shí) ERR-α為細(xì)胞核表達(dá),在人骨骼肌中表達(dá)豐富。Ⅰ型胞漿表達(dá)較深的病例,ERR-α核染色評分也較高。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示OSAS患者腭咽肌肌型分布發(fā)生改變,Ⅰ型纖維比例減少,而Ⅱx型纖維比例增加。兩組Ⅰ、Ⅱx型纖維百分比差異具有顯著性(Ⅰ型23.89±24.20vs44.45±16.27,t=3.257,P 值 0.0020.05;Ⅱx 型41.91±21.98vs24.09±10.85,t=-2.799,P 值 0.0080.05)。而兩組間 Ⅱa、Ⅱb 型纖維百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、分化期ERR-α表達(dá):C2C12細(xì)胞分化期ERR-α mRNA的表達(dá)較分化前均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Welch值17.34,P=0.001)。相比于分化前,MT-1為 2.20±0.64 倍(P=0.0270.05),MT-3 達(dá) 2.7l±0.97(P=0.0340.05),MT-5為1.57±0.30倍,(P=0.0260.05),蛋白水平也證實(shí)其呈動態(tài)改變。4、ERR-αSiRNA的瞬轉(zhuǎn)試驗(yàn):ERR-αmRNA表達(dá)干擾后(0.48倍,T值4.367,P=0.0050.05),明顯抑制細(xì)胞分化,并且主要是抑制氧化型Ⅰ型纖維的形成(0.31 倍,T 值 11.275,P=0.0010.05),而糖酵解型纖維 Ⅱib(T 值 0.029,P=0.9770.05)表達(dá)無抑制。Western blot證實(shí)蛋白水平的改變。5、細(xì)胞間隙低氧試驗(yàn):相比于常規(guī)培養(yǎng),3%間隙低氧條件下,C2C12細(xì)胞分化受到抑制,肌管形成減少。分化第1天(16.573±1.407vs26.852±3.881,T=4.313,P=0.0130.05)、分化第 3 天(180.14±57.75vs335.72±21.93,T=4.362,P=0.0120.05)、分化第 5 天(341.18 ± 8.97vs484.33 ± 33.39,T=3.582,P=0.0230.05)慢肌纖維Ⅰ基因表達(dá)較常規(guī)組明顯下降,差異具有顯著性。3%CIH條件下 ERR-α 在分化第 1 天(1.457±.567vs3.628±.884,T 值 3.582,P=0.0230.05)表達(dá)下降,差異有顯著性;而各時(shí)期快肌纖維表達(dá)無改變。6、ER刺激及XCT逆轉(zhuǎn)試驗(yàn):ER刺激試驗(yàn)表明,不同梯度ER刺激下,ERR-α氧化型慢�、裥屠w維表達(dá)逐步增加,以 10-10M 最為顯著(Myhc slow,fold 4.378,P=0.0010.05;ERR-α,fold3.517,P=0.0020.05)。而糖酵解型快�、騜型纖維總體變化趨勢不大。因此E2可促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化,主要是通過增加Ⅰ型纖維纖維的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。ER+XCT790 逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)證明,10-7、10-8、10-9M 的 ER+XCT790 條件下,ERR-α、慢�、裥屠w維表達(dá)均明顯下降,以10-7M ER+XCT790條件下最為顯著(ERR-αfold 0.26,P=0.000、Myhc slow fold 0.24,P=0.0000.05)。在促進(jìn)細(xì)胞分化作用最顯著的10-10ER條件下,加入XCT790,則各基因表達(dá)變化并不明顯。故ER促進(jìn)細(xì)胞分化的作用可被ERR-α特異性拮抗劑逆轉(zhuǎn);ER促進(jìn)細(xì)胞分化、增加氧化型Ⅰ型纖維的作用正是通過ERR-α來實(shí)現(xiàn)的。7、動物試驗(yàn):去卵巢組術(shù)后2周子宮重量較假手術(shù)對照組明顯下降(T值6.812,P=0.0000.05),差異具有顯著性。SD大鼠自身胸舌骨肌去卵巢手術(shù)前后自身對照,qRT-PCR提示去卵巢組手術(shù)前后自身ER水平改變可引起ERR-α(1.324±0.596vs0.534±0.710,t 值 5.468,P=0.0320.05)、Myhc slow 慢肌纖維(1.494±0.716vs0.694±0.296,t 值 3.038,P=0.0380.05)表達(dá)下降,Myhc fast快肌纖維表達(dá)(1.032±0.240vs0.914±0.199,t 值 0.628,P=0.5640.05)無改變。而對照組ERR-α(1.244±.565vs1.294±0.510,t值-0.349,P=0.7450.05)、Myhc slow(1.39±1.28vs1.27±0.94,t值0.909,P=0.4150.05)、快肌纖維(1.298±0.497vs1.37±0.599,t 值-0.952,P=0.3950.05)表達(dá)均無差異。免疫組化染色證實(shí)蛋白水平變化。結(jié)論:1.OSAS患者存在上氣道擴(kuò)張肌重塑,其病理損傷包括肌纖維內(nèi)部損傷(如肌纖維分葉狀或蟲蝕狀改變、不整紅邊纖維、群組化分布、壞死肌纖維、肌內(nèi)膜和肌束膜連接組織增生等),以及肌纖維類型分布異常,Ⅰ型纖維比率下降。2.OSAS患者腭咽肌肌型分布較對照組發(fā)生改變,Ⅰ型纖維比例減少,而Ⅱx型纖維比例增加,差異具有顯著性;而兩組間Ⅱa、Ⅱb型纖維百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.ERR-α在OSAS患者腭咽肌中表達(dá)下調(diào),組織免疫組化染色進(jìn)一步證實(shí)Ⅰ型胞漿表達(dá)較深的病例,ERR-α核染色評分也較高。提示其可能和OSAS患者肌纖維分布變化相關(guān);4.C2C12細(xì)胞分化過程中ERR-α呈動態(tài)表達(dá),其表達(dá)失調(diào)影響肌纖維的分化結(jié)果,并參與間隙低氧條件下的肌纖維類型轉(zhuǎn)換。5.動物試驗(yàn)、細(xì)胞試驗(yàn)均證實(shí)ER水平變化可導(dǎo)致肌纖維類型發(fā)生轉(zhuǎn)化,并且在細(xì)胞水平被ERR-α特異性拮抗劑逆轉(zhuǎn)。6.ERR-α通過調(diào)控氧化型慢�、裥屠w維的表達(dá),改變肌肉的收縮特性、收縮動力學(xué),進(jìn)而影響OSAS患者上氣道擴(kuò)張肌的功能狀態(tài),在其發(fā)病進(jìn)程中扮演重要角色。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R766

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