發(fā)布時間：2018-03-24 10:25

  本文選題：水楊酸鈉　切入點(diǎn)：螺旋神經(jīng)節(jié)　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：耳聾是耳鼻咽喉科的常見病和難治性疾病。在我國,聽力障礙殘疾者居各類殘疾人群之首。由于濫用抗生素、急慢性中耳炎及突發(fā)性耳聾得不到及時有效的治療、噪聲的污染不斷增加及人口老齡化等諸多因素的影響,我國耳聾的發(fā)病率逐年上升。因此,深入探討耳聾發(fā)病機(jī)制,開發(fā)防聾治聾的藥物及治療手段成為醫(yī)學(xué)上迫切需要解決的難題之一。水楊酸鈉,是阿司匹林的活性成分,是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的抗炎止痛藥物之一。然而,在水楊酸類藥物使用過程中,常伴隨著不少的副作用,尤以耳毒性最為常見,主要表現(xiàn)為耳鳴和聽力下降。但其具體作用機(jī)制目前仍未完全明了。耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)(SGN)是連接毛細(xì)胞與聽覺中樞的重要樞紐,也是水楊酸鈉耳毒性的重要作用位點(diǎn)。根據(jù)近期報道,水楊酸鈉作用于體外培養(yǎng)的耳蝸器官幾天后,選擇性地造成SGN及其神經(jīng)纖維的損傷,但其具體作用機(jī)理尚未明確。為明確水楊酸鈉誘導(dǎo)SGN損傷的具體機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)擬采用水楊酸鈉作用于體外培養(yǎng)的耳蝸器官,通過免疫熒光染色觀察水楊酸鈉所致SGN損傷的形態(tài)學(xué)改變,明確其損傷類型；通過DHE熒光探針觀察水楊酸鈉處理后培養(yǎng)物中過氧化物陰離子的含量,探討過氧化物產(chǎn)生與水楊酸鈉所致SGN損傷的關(guān)系；通過caspase熒光試劑盒觀察水楊酸鈉處理過程中,SGN中凋亡啟動因子caspase-8, caspase-9及凋亡執(zhí)行因子caspase-3的活動情況,探索水楊酸鈉所致SGN凋亡的信號通路。通過上述實(shí)驗(yàn)探討介導(dǎo)水楊酸鈉所致SGN凋亡的具體機(jī)制。此外,水楊酸鈉所致SGN出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)損傷需要長達(dá)數(shù)天的時間,那么除了導(dǎo)致處理晚期SGN損傷的直接因素外,很可能有其他機(jī)制參與了水楊酸鈉處理早期的過程。因此,本實(shí)驗(yàn)室還通過免疫熒光染色,觀察水楊酸鈉處理早期SGN中表面及總體NMDAR1的變化情況。同時,結(jié)合western blot技術(shù),量化水楊酸鈉處理早期SGN中表面及總體NMDAR1蛋白含量的改變,探討NMDA受體內(nèi)化在水楊酸鈉處理早期中的作用。通過本實(shí)驗(yàn)將有利于揭開水楊酸鈉處理早期及晚期導(dǎo)致SGN損傷的具體機(jī)制,為進(jìn)一步研究水楊酸耳毒性提供新的理論根據(jù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分為以下兩部分： 一水楊酸鈉誘導(dǎo)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)凋亡機(jī)制的研究 [研究目的]明確水楊酸鈉所致SGN損傷的類型,探討過氧化物與SGN損傷的關(guān)系。 [研究方法]以出生2-3天SASCO-Sprague-Dawley大鼠乳鼠為實(shí)驗(yàn)動物,體外培養(yǎng)包括corti器及SGN在內(nèi)的耳蝸器官組織。將培養(yǎng)的耳蝸器官分為正常對照組,3mM、5mM、10mM水楊酸鈉處理組,培養(yǎng)48小時或96小時；50μM Z-VAD-FMK組,50μM Z-VAD-FMK+3mM、5mM、10mM水楊酸鈉干預(yù)組；100μM PyP組,100μM PyP+3mM、5mM、10mM水楊酸鈉干預(yù)組；0.2mMAP5組,0.2mM AP5+3mM、5mM、10mM水楊酸鈉干預(yù)組；處理48小時。用抗Ⅲ型β-微管蛋白的單克隆抗體標(biāo)記SGN,鬼筆環(huán)肽標(biāo)記毛細(xì)胞,To-Pro-3標(biāo)記細(xì)胞核。采用caspase熒光試劑盒觀察SGN中凋亡啟動因子caspase-8, caspase-9及凋亡執(zhí)行因子caspase-3在水楊酸鈉處理后的活動情況。用DHE熒光探針檢測培養(yǎng)物中過氧化物陰離子的含量。 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果](1)3mM、5mM、10mM水楊酸鈉處理48小時或96小時后,均未造成明顯的內(nèi)、外毛細(xì)胞缺失或損傷。 (2)3mM、5mM、10mM水楊酸鈉處理48小時或96小時后,SGN神經(jīng)纖維出現(xiàn)神經(jīng)斷裂,水泡化,神經(jīng)纖維束萎縮變細(xì)甚至斷裂、消失的形態(tài)學(xué)改變,且這種損傷,呈濃度與時間依賴性。 (3)3mM、5mM、10mM水楊酸鈉處理48小時或96小時后,SGN胞體萎縮變小,細(xì)胞核固縮、碎裂、邊集呈典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變,且這種損傷,呈濃度與時間依賴性。培養(yǎng)48小時后,對照組中SGN凋亡率為20.61±6.165%,3mM、5mM、10mM水楊酸鈉處理后,SGN凋亡率分別升高到68.34±7.193%,83.80±8.481%,88.14±7.424%(P0.05)。培養(yǎng)96小時后,對照組中SGN凋亡率為20.76±6.690%,而3mM、5mM、10mM水楊酸鈉處理后,凋亡率進(jìn)一步升高到85.57±9.137%,95.42±4.280%,97.97±2.987%(P0.05)。 (4)處理12小時后,對照組SGN中活性caspase-3,-8和-9的陽性率分別為5.91±5.517%,6.870±3.064%,6.62±3.492%；10mM水楊酸鈉處理12小時后,其活性沒有明顯改變,分別為6.69±6.445%,7.67±2.141%,5.70±3.307%(p0.05)；而水楊酸鈉處理24小時后,caspase活性稍有上升,分別為14.42±6.392%,18.76±12.030%,13.04±7.129%,但仍未有顯著差異(p0.05)；處理48小時后,對照組中caspase-3,-8,-9的活性分別為10.23±4.810%,12.15±6.660%,8.610±2.636%；10mM水楊酸鈉處理48小時后各活性caspase顯著增加,分別為75.19±10.420%,79.40±11.290%,63.98±9.143%(p0.05).用泛caspase抑制劑Z-VAD-FMK(50μM)對水楊酸鈉所致SGN凋亡進(jìn)行干預(yù),分別予3mM、5mM、10mM水楊酸鈉共處理后,SGN的凋亡率分別20.32±7.526%,65.55±11.190%,80.13±7.867%,85.69±6.984%,與單獨(dú)使用水楊酸鈉處理無明顯差異(P0.05)。 (5)用DHE染色檢測10mM水楊酸鈉處理48小時后耳蝸器官培養(yǎng)物中過氧化物陰離子的含量發(fā)現(xiàn),過氧化物陰離子染色特異性出現(xiàn)在SGN中,支持細(xì)胞及毛細(xì)胞中未見有明顯DHE染色。對照組SGN中DHE染色陽性率為11.07±3.523%,10mM水楊酸鈉處理組中則增長至56.12±8.316%(p0.05)。用100μM過氧化物抑制劑PyP單獨(dú)處理48小時后,SGN中DHE染色陽性率為10.40±2.620%,與單純對照組相比無明顯差異(p0.05)。但當(dāng)100μM PyP+10mM水楊酸鈉干預(yù)后,SGN中的凋亡率下降到25.04±6.107%(p0.05),PyP顯著抑制了水楊酸鈉處理后SGN中過氧化物陰離子的增長。同時,PyP干預(yù)后還明顯抑制了水楊酸鈉對SGN及其神經(jīng)纖維的損傷作用。PyP+3mM水楊酸鈉干預(yù)組中,神經(jīng)纖維無明顯形態(tài)學(xué)損傷,而PyP+5或10mM水楊酸鈉處理后,神經(jīng)纖維損傷也只有出水泡的改變。PyP+3mM、5mM、10mM水楊酸鈉處理后,SGN的凋亡率分別下降到31.86±8.101%,32.68±7.166,35%,71±10.040%,與單獨(dú)使用水楊酸鈉處理組相比差異顯著((p0.05)。 (6)用NMDA受體抑制劑AP5對水楊酸鈉所致SGN凋亡進(jìn)行干預(yù),0.2mM AP5,0.2nM AP5+3mM.5mM.10mM水楊酸鈉處理后,SGN的凋亡率分別14.95±5.420%,61.39±9.535%,75.56±11.710%,82.58±9.074%,與單獨(dú)使用水楊酸鈉處理無明顯差異(P0.05)。 [小結(jié)]在體外培養(yǎng)的大鼠耳蝸器官中,水楊酸鈉選擇性損傷SGN及其神經(jīng)纖維,并呈濃度和時間依賴性。水楊酸鈉誘導(dǎo)的SGN凋亡可同時由caspase依賴性與caspase非依賴性細(xì)胞凋亡通路介導(dǎo),其中caspase通路同時啟動了胞外死亡受體相關(guān)通路和胞內(nèi)線粒體通路。水楊酸鈉誘導(dǎo)SGN凋亡與超氧化物陰離子產(chǎn)生增加有關(guān),應(yīng)用超氧化物陰離子抑制劑可部分抑制這種損傷,但NMDA受體抑制劑不能抑制這種損傷。 二水楊酸鈉作用于耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)早期機(jī)制的研究 [研究目的]探索NMDA受體內(nèi)化與水楊酸鈉對SGN早期作用機(jī)制的關(guān)系 [研究方法]以出生2-3天SASCO-Sprague-Dawley大鼠乳鼠為實(shí)驗(yàn)動物,體外培養(yǎng)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)組織。設(shè)立對照組及3mM水楊酸鈉組,分別處理15分鐘或6小時。用抗Ⅲ型β-微管蛋白的單克隆抗體標(biāo)記SGN, To-Pro-3標(biāo)記細(xì)胞核。用抗NMDAR1抗體分別標(biāo)記SGN表面和總體NMDAR1,再分別用與Alexa Fluor488偶聯(lián)的二抗標(biāo)記表面NMDAR1,用與Cy-3偶聯(lián)的二抗標(biāo)記總體NMDAR1,觀察水楊酸鈉處理后SGN表面及總體NMDAR1的表達(dá)變化。用生物素標(biāo)記表面蛋白,結(jié)合Western blot技術(shù)檢測水楊酸鈉處理前后SGN表面及總體NMDAR1蛋白的變化。 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果](1)3mM水楊酸鈉處理15分鐘或6小時均未造成SGN顯著形態(tài)學(xué)損傷。 (2)3mM水楊酸鈉處理15分鐘后,SGN表面NMDAR1表達(dá)明顯下降,總體NMDAR1無明顯改變。 (3)3mM水楊酸鈉處理15分鐘后,與對照組相比SGN表面NMDAR1蛋白明顯下降,下降率為38.15%(p0.05)；處理6小時后,與對照組相比SGN表面NMDAR1蛋白無明顯改變(p0.05)。 (4)3mM水楊酸鈉處理15分鐘后,與對照組相比SGN總體NMDAR1蛋白無明顯變化(p0.05)；處理6小時后,與對照組相比SGN總體NMDAR1蛋白表達(dá)增高1.90倍(p0.05)。 [小結(jié)]水楊酸鈉處理早期,SGN未出現(xiàn)明顯形態(tài)學(xué)損傷之前,短期處理可誘導(dǎo)SGN表面NMDAR1內(nèi)化,較長時間處理后可誘導(dǎo)總體NMDAR1表達(dá)增高。 [總體結(jié)論](1)水楊酸鈉可選擇性誘導(dǎo)SGN凋亡,并呈濃度和時間依賴性。 (2)水楊酸鈉誘導(dǎo)的SGN凋亡與caspase依賴通路及caspase非依賴通路均相關(guān),其中caspase通路同時啟動了胞外死亡受體相關(guān)通路和胞內(nèi)線粒體通路。 (3)水楊酸鈉誘導(dǎo)的SGN凋亡與過氧化物陰離子產(chǎn)生增高有關(guān),選擇性應(yīng)用過氧化物抑制劑可抑制水楊酸鈉對SGN的損傷,但NMDA受體抑制劑不能抑制這種損傷。 (4)水楊酸鈉處理早期,SGN未出現(xiàn)形態(tài)學(xué)損傷前,短期處理可誘導(dǎo)SGN表面NMDAR1內(nèi)化,較長時間處理后可誘導(dǎo)總體NMDAR1表達(dá)增高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R764.43

【參考文獻(xiàn)】

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1 房秀友;唐小蘭;鄧?yán)?蘇紀(jì)平;;實(shí)時熒光定量PCR檢測大鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元NMDA受體亞單位的基因表達(dá)[J];山東醫(yī)學(xué)高等�？茖W(xué)校學(xué)報;2011年03期

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本文編號：1657888