本文選題：鼻咽癌　切入點(diǎn)：腫瘤干細(xì)胞　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：研究背景和目的 鼻咽癌(NPC)是一種發(fā)生于鼻咽粘膜的惡性腫瘤。占頭頸部惡性腫瘤的78.08%,占上呼吸道癌腫的92.99%。我國是鼻咽癌發(fā)病率最高的國家,而廣東、廣西、海南等地都是高發(fā)區(qū),其發(fā)病率大約是25-50例每100,000人,高于西方國家25倍。由于其特殊的解剖位置,所以手術(shù)的方法受到局限,因此治療主要依賴于放射治療。然而,即使給予根治劑量,5年內(nèi)仍有約30%的患者出現(xiàn)局部腫瘤復(fù)發(fā),30%至60%的患者發(fā)生轉(zhuǎn)移。 腫瘤干細(xì)胞(CSC/TSC)的概念于2001年被正式提出。腫瘤干細(xì)胞具有四個(gè)重要特征：1、自我更新的能力。自我更新能力是腫瘤干細(xì)胞保持分化為前體細(xì)胞的能力。2、多分化潛能。多分化潛能使腫瘤干細(xì)胞能夠產(chǎn)生不同分化程度的子代腫瘤細(xì)胞,在體內(nèi)形成新的腫瘤。同一腫瘤組織中,分化成熟的腫瘤細(xì)胞惡性程度較低,而分化差的腫瘤細(xì)胞惡性程度高。3、高增值能力。大量實(shí)驗(yàn)表明,CSC/TSC比普通腫瘤細(xì)胞具有更高的增值能力。4、耐藥性。多藥耐藥是導(dǎo)致腫瘤治療失敗的主要原因之一。腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞膜上多數(shù)表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體家族膜蛋白,能夠運(yùn)輸并排出代謝產(chǎn)物,藥物等物質(zhì),使得許多對腫瘤非干細(xì)胞具有抑制或殺傷作用的化療藥物在腫瘤干細(xì)胞上發(fā)揮不了殺傷作用,或作用明顯減弱。目前,使用干細(xì)胞表面標(biāo)記ALDH1+、CD44、CD133等,可以識別乳腺、腦、肺、肝癌的干細(xì)胞。最近的一項(xiàng)研究表明,干細(xì)胞可以通過優(yōu)先激活CHK1和CHK2的細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn),增加DNA修復(fù)能力從而引起輻射耐受。 c-MYC基因是MYC基因家族的重要成員之一,是一種可使細(xì)胞無限增殖,獲永生化功能,促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因,因與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。c-MYC基因的表達(dá)一般與細(xì)胞的生長狀態(tài)有關(guān),然而在細(xì)胞分化時(shí)c-MYC表達(dá)則降低,發(fā)現(xiàn)c-MYC在細(xì)胞GO期到S期的過程中也起作用。表明c-MYC表達(dá)的變化與細(xì)胞的增殖及分化狀態(tài)有關(guān),其表達(dá)產(chǎn)物在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化或惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。MYC可以通過抑制p27激活cyclin E/Cdk2使成纖維細(xì)胞靜止。以往的研究還表明,MYC可以同時(shí)激活p53和pten引起正常的和惡性干/祖細(xì)胞的分化,自我更新,及致瘤性。 本研究的目的是,根據(jù)PKH26熒光染料的特性,識別具有慢周期特性的PKH26+細(xì)胞,通過明確c-MYC對CHK1/2.的直接調(diào)節(jié)作用,闡述PKH26+細(xì)胞具有輻射抗性的機(jī)制,旨在揭示c-MYC介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)在鼻咽癌放療抵抗中的作用。 方法 1.細(xì)胞和培養(yǎng)條件 本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。人鼻咽癌細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,青霉素100U/ml,鏈霉素100μg/ml,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分選后的PKH26+以及PKH26-細(xì)胞使用的是無血清的未分化培養(yǎng)基(MEBM; Clonetics division of Cambrex BioScience)進(jìn)行維持培養(yǎng)。 2.腫瘤球培養(yǎng)： 將分選鼻咽癌細(xì)胞及經(jīng)過不同方式處理后的細(xì)胞,置于低粘附培養(yǎng)板中,用含DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng),含2%N2,2%B27,20ng/mL HGF,100ng/mLEGF, and1%真菌抗生素,懸浮于培養(yǎng),觀察細(xì)胞形成腫瘤干細(xì)胞球的過程。 3.免疫熒光 將待檢測樣品放入放有蓋玻片的6孔板中,4%多聚甲醛固定,PBS清洗,0.5%Triton X-100破膜,PBS清洗,加入一抗37℃孵育45min, PBS清洗,洗滌后加入熒光二抗,37℃孵育45min, PBS清洗,DAPI染細(xì)胞核,在共聚焦顯微鏡下觀察。 4.細(xì)胞周期分析 用胰蛋白酶消化細(xì)胞,用PBS洗滌,在懸浮在70%乙醇中,-20℃并儲存過夜。隨后離心,在PBS中洗滌,再懸浮在450ml的PBS和10ml,10mg/ml無DNase的RNase中,在37℃孵育45分鐘。RNase處理后,溶液中加入501μl的PI,細(xì)胞在室溫下孵育10分鐘,避光。分析之前,通過過濾除去細(xì)胞團(tuán)塊,使用BDFACSDiva,對細(xì)胞周期進(jìn)行了分析。 5.側(cè)群細(xì)胞檢測 將貼壁細(xì)胞或處理后的腫瘤細(xì)胞分離成單個(gè)細(xì)胞,離心后用PBS清洗,含2%胎牛血清的1640培基重懸,用Hoechst33342標(biāo)記,標(biāo)記的細(xì)胞在37℃孵育90min, PBS洗滌,重懸,檢測前加入Propidium Iodide標(biāo)記死細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測側(cè)群比例。 6.免疫印跡檢測 蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行分析,將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,PVDF膜浸泡在封閉液中25℃2h,一抗4℃孵育過夜,PVDF膜與二抗在室溫下孵育1h,采用化學(xué)發(fā)光法檢測。 使用以下抗體：鼠抗人cyclin D1, cyclin A, and cyclin B (1:300),鼠抗人ABCG2, CD-44, CHK1, CHK2, pCHK1, pCHK2GAPDH(1:1,000),和γ-H2AX(1：1,000)。 7.克隆形成生存分析 將剛分選的PKH26+和PKH26細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),并接種于6孔培養(yǎng)板。在室溫下,使用直線加速器(2100EX,瓦里安)進(jìn)行照射,劑量率300cGy的/分鐘,并培養(yǎng)14天。接著,將存活的克隆數(shù)目(定義為具有≥50個(gè)細(xì)胞的菌落)進(jìn)行計(jì)數(shù)。 8.免疫組織化學(xué) 石蠟切片經(jīng)脫蠟,乙醇梯度水化,抗原修復(fù),滅活內(nèi)源性過氧化物酶,一抗4℃孵育過夜,二抗25℃孵育lOmin,DAB顯色,顯微鏡觀察顯色,蘇木素復(fù)染核,鹽酸乙醇分化,脫水,透明。 9.實(shí)時(shí)定量(定量RT-PCR) 表達(dá)CHK1, CHK2, c-MYC使用的Taq-Man(?) MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,TaqMan通用PCR擴(kuò)增預(yù)混試劑,根據(jù)由制造商提供的說明,使用二步法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR測定,GAPDH作為內(nèi)參歸一化。 10.熒光素酶檢測 pGL4-hRluc/TK載體購自Promega公司。選定CHK1和CHK2的啟動子基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并克隆到pGL4載體中。根據(jù)制造商提供的說明書,使用雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega),檢測熒光素和Renilla熒光素酶的活性。在CHK1和CHK2啟動子區(qū)域,突變c-MYC基因與其結(jié)合位點(diǎn),使用QuikChange多定點(diǎn)突變試劑盒(Stratagene公司)根據(jù)制造商提供的使用說明書對相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行突變。 11. c-MYC綁定位點(diǎn)預(yù)測和ChIP實(shí)驗(yàn) c-MYC在CHK1, CHK2啟動子區(qū)域的綁定位點(diǎn)的預(yù)測使用的是Patch軟件(http://www.biobase-international.com/gene-regulation)來自CNE2細(xì)胞的DNA的準(zhǔn)備和細(xì)胞的裂解使用的是EZ-Zyme Chromatin Prep試劑盒(Millipore)。裂解后的樣品是用EZ-Magna ChIP試劑盒(Millipore)。所有的步驟均按照說明書進(jìn)行操作。用來做CHIP的抗c-MYC抗體來自Santa Cruz Biotechnology, Inc在CHIP分析準(zhǔn)備完成以后,DNA樣品的擴(kuò)增使用的引物見正文。 12.體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 接種時(shí)細(xì)胞用100μl按1:1RPMI-1640和Matrigel懸浮,觀察其成瘤情況如下,記錄小鼠腫瘤發(fā)生的時(shí)間；根據(jù)公式V=1/ab2(a為長徑,b為短徑)計(jì)算腫瘤體積,繪制腫瘤成長曲線,腫瘤生長數(shù)周后處死動物取出腫瘤組織。 13.統(tǒng)計(jì)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件Graphpad5.0對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組腫瘤體積比較采用兩獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)；腫瘤球形成,PKH26陽性細(xì)胞和側(cè)群比例,細(xì)胞周期,動物成瘤時(shí)間數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較各組差異,如方差齊性,多重比較采用LSD法；如方差不齊,采用Welch值,多重比較采用Dunnett T3法；在體腫瘤生長曲線的比較采用兩因素方差分析(two-way ANOVA)比較各組間差異。P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)果 1.鼻咽癌中PKH26+細(xì)胞的生物學(xué)特性 在不同時(shí)間段用流式細(xì)胞儀檢測PKH26+細(xì)胞的比例,在第四周CNE1為2.2%,CNE2為2.8%,分選這個(gè)比例的PKH26+的細(xì)胞進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn),檢測PKH26+細(xì)胞的細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)主要處于G1期(DNA合成前期),細(xì)胞周期蛋白cyclinD1, A在PKH26+的細(xì)胞中也高表達(dá)。分別檢測CNE1和CNE2細(xì)胞中的側(cè)群比例,可以看到PKH26+的細(xì)胞中比例明顯高于PKH26-的細(xì)胞。WesternBlot檢測干細(xì)胞表面標(biāo)記ABCG2和CD44也證實(shí)了這一點(diǎn)。經(jīng)過照射后PKH26+的細(xì)胞腫瘤球數(shù)目明顯多于PHK26-的細(xì)胞；克隆形成實(shí)驗(yàn)評價(jià)照射后PKH26+和PKH26-細(xì)胞的存活率,經(jīng)過8Gy的照射PKH26+的細(xì)胞克隆和照射前無明顯差別,而PKH26-的細(xì)胞8Gy基本上都?xì)⑺懒恕?2.PKH126+細(xì)胞引起的輻射抗性主要是通過c-MYC過表達(dá)。 給予PKH26+和PKH26-細(xì)胞8Gy的劑量,Western Blot檢測pCHK1、 pCHK2、CHK1、CHK2個(gè)基因,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過照射PKH26+和PKH26-細(xì)胞中CHK1和CHK2磷酸化水平均提高,但是,PKH26+細(xì)胞的磷酸化活化水平明顯高于PKH26-的細(xì)胞,表明PKH26+細(xì)胞表現(xiàn)出更大DNA損傷激活反應(yīng)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn),細(xì)胞照射后PKH26+細(xì)胞c-MYC,pChk1, pChk2表達(dá)的增加,而且這三個(gè)基因均定位于細(xì)胞核中PKH26+細(xì)胞。為了闡明c-MYC和DNA損傷反應(yīng)之間的關(guān)系,我們在鼻咽癌細(xì)胞株CNE1和CNE2中構(gòu)建了c-MYC的過表達(dá)載體。我們發(fā)現(xiàn),DNA損傷相關(guān)蛋白γ-H2AX的水平大大降低。在彗星實(shí)驗(yàn),顯示CNE1和CNE2細(xì)胞中過度表達(dá)c-Myc基因,DNA損傷細(xì)胞的比例明顯下降了。生物信息學(xué)的方法檢測了CHK1和CHK2基因上游約2000bp,分別發(fā)現(xiàn)了三個(gè)潛在的c-MYC基因的結(jié)合位點(diǎn)。在CNE2中進(jìn)行(ChIP)分析c-MYC的所有假定位點(diǎn)。研究結(jié)果表明,c-MYC是最顯著綁定的位點(diǎn)是CHK1和CHK2的C和E位點(diǎn)。敲除c-MYC的可以減弱c-MYC與CHK1和CHK2的C和E位點(diǎn)的結(jié)合。熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)c-MYC基因過表達(dá),也可以使CHK1和CHK2的熒光素酶表達(dá)增加,突變C和E位點(diǎn)結(jié)果表明,突變后c-MYC基因的過度表達(dá)沒有使CE位點(diǎn)熒光素酶的活性增加。 3. c-MYC過表達(dá)增強(qiáng)PHK26+細(xì)胞的DNA修復(fù)能力和干性 先在鼻咽癌細(xì)胞中沉默c-MYC基因,檢測照射后c-MYC表達(dá)和DNA損傷反應(yīng),緊接著,在PKH26+細(xì)胞中抑制c-MYC側(cè)群細(xì)胞比例減少,CNE1的PKH26+細(xì)胞側(cè)群比例從32.8%降至2.4%,CNE2的PKH26+細(xì)胞側(cè)群比例從35.67%降至2.0%。為了進(jìn)一步證實(shí)我們的假設(shè),我們收集CNE1和CNE2細(xì)胞株的PKH26+細(xì)胞進(jìn)行腫瘤球形成實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)抑制c-MYC可以減少的腫瘤球數(shù)目。堿性彗星試驗(yàn)中,我們用shc-MYC處理PKH26+細(xì)胞與對照組相比,損傷明顯增加。 4. c-MYC基因通過調(diào)節(jié)Chk1/2介導(dǎo)PKH26+細(xì)胞的DNA損傷反應(yīng)和抗輻射 在CNE1和CNE2中抑制CHK1/2,用WB檢測抑制效率。然后用彗星實(shí)驗(yàn)證實(shí)慢病毒載體sh-Chk1/2干擾Chk1/Chk2的表達(dá)能使PKH26+細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力減弱。緊接著,對PKH26+細(xì)胞進(jìn)行了為了c-MYC和CHK1/2的共感染,通過克隆形成實(shí)驗(yàn)、Western Blot檢測,發(fā)現(xiàn)PKH26+細(xì)胞耐放療。此外,c-MYC基因的抑制可以引起PKH26+細(xì)胞對放射敏感.c-MYC基因介導(dǎo)的DNA修復(fù)取決于CHK1/2的活化。把分選的PKH26+細(xì)胞對裸鼠進(jìn)行皮下注射。結(jié)合腫瘤的體積和重量,我們發(fā)現(xiàn)給予不同的射線治療方式或Si-C-MYC并被沒有顯著的抑制腫瘤生長,si-c-MYC與放療進(jìn)行聯(lián)合則可以明顯抑制腫瘤生長。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)與未處理的腫瘤相比,用IR和si-c-MYC處理的腫瘤c-MYC, CHK1/2,和pCHK1/2表達(dá)水平降低。我們用免疫組織化法在62例原發(fā)的鼻咽癌標(biāo)本檢測這些基因的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)c-MYC基因的高表達(dá)與CHK1/2和CD44的表達(dá)水平呈正相關(guān)。 結(jié)論 1.鼻咽癌細(xì)胞中PKH26+的細(xì)胞群體,有許多干細(xì)胞的特性,包括細(xì)胞周期阻滯,無限的自我增殖更新能力,腫瘤形成能力。 2. c-MYC結(jié)合CHK1/2的啟動子調(diào)控DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)反應(yīng),引起鼻咽癌細(xì)胞的耐放療。 3.抑制c-MYC的或CHK1/2可以克服在體外和體內(nèi)的鼻咽癌輻射抗性
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 盧泰祥;局部復(fù)發(fā)鼻咽癌診治研究進(jìn)展[J];癌癥;2004年02期

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本文編號：1656947