本文選題：喉癌　切入點(diǎn)：標(biāo)本庫(kù)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：頭頸部鱗癌是第六位最常見惡性腫瘤,喉癌是頭頸部腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一,在呼吸道腫瘤中發(fā)病率居第二位,以鱗狀細(xì)胞癌為主,約占95%。隨著工業(yè)化的發(fā)展和空氣污染的加重,喉癌在我國(guó)以及世界范圍內(nèi)其發(fā)病率呈逐步上升趨勢(shì)。有調(diào)查表明,喉癌的發(fā)病率不斷升高,每年約增加25%。而且,根據(jù)最新的研究,雖然近30年來新的外科手術(shù)方法、化療藥物、更先進(jìn)的放射治療手段以及靶向藥物已應(yīng)用在喉癌的治療中,喉癌患者的總生存率不但并未得到提高,甚至有下降的趨勢(shì),僅約50%,晚期喉癌的生存率更低達(dá)30～40%�？傮w治療效果仍難令人滿意。 一般認(rèn)為,喉癌的不良預(yù)后通常與腫瘤晚期診斷、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)。目前關(guān)于喉癌預(yù)后不良的相關(guān)因素的研究結(jié)果差異較大,進(jìn)一步了解影響喉癌術(shù)后生存和預(yù)后的密切相關(guān)因素,可為喉癌患者預(yù)后評(píng)估及個(gè)體化治療策略制定提供必要的依據(jù)。 提高喉癌早期診斷率、復(fù)發(fā)傾向的早期預(yù)測(cè)及有效干預(yù)措施是進(jìn)一步提高喉癌療效的關(guān)鍵。盡管隨著影像技術(shù)的進(jìn)步以及高清內(nèi)鏡的普及使用,可為臨床醫(yī)生提供了早期診斷喉癌的手段,然而傳統(tǒng)的喉癌病理診斷方法等是從細(xì)胞水平反映腫瘤的生物學(xué)特征,具有局限性,不能充分反映腫瘤的真實(shí)本質(zhì)。隨著分子醫(yī)學(xué)的進(jìn)步,研究已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤在分子水平具有不同的表型,這種分子的變異譜與腫瘤的預(yù)后及療效預(yù)測(cè)相關(guān)。研究喉癌的分子機(jī)制并尋找特異的治療靶點(diǎn)是提高喉癌療效的關(guān)鍵。 microRNA (microRNA, miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種廣泛存在于多細(xì)胞生物中的小分子RNA,長(zhǎng)度為20-22個(gè)核苷酸,其本身不是編碼蛋白質(zhì),它們是在轉(zhuǎn)錄后水平起調(diào)節(jié)作用。microRNA在人類基因組中只占整個(gè)基因組基因總數(shù)的2%左右,但可能有超過30%的基因受miRNA調(diào)控,越來越多的研究顯示微小RNA變異譜可能在腫瘤生物學(xué)行為過程中起非常重要的作用。每個(gè)miRNA可以控制數(shù)百個(gè)基因的表達(dá),在基因組的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。miRNAs調(diào)控腫瘤的生物學(xué)特性是可能作為抑癌基因,下調(diào)靶原癌基因的活性,也可作為促癌基因,下調(diào)靶抑癌基因的活性。在不少疾病尤其明顯的是在腫瘤中,miRNA的表達(dá)譜具有一定的特征性改變。人們發(fā)現(xiàn)對(duì)不同腫瘤特定的miRNA水平進(jìn)行分析,有助于腫瘤的早期診斷和預(yù)后評(píng)估。miRNAs的研究為探索喉癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制、尋找新的診斷標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)提供了很有前景的研究方向。 最新的研究方法及技術(shù)主要包括生物信息學(xué)方法和先進(jìn)的基因芯片技術(shù)等實(shí)驗(yàn)生物學(xué)方法為microRNA的研究提供了非常良好的手段。這些技術(shù)與方法已成功應(yīng)用于多種腫瘤的研究中并顯示出其顯著地優(yōu)越性。 喉癌的microRNA研究處于起步階段,目前在喉癌miRNA的相關(guān)研究仍存在許多不足之處：多為頭頸鱗癌的研究,單純喉癌研究很少,結(jié)果差異較大。既往的研究提示我們,可利用基因芯片等先進(jìn)高效的技術(shù)平臺(tái)篩選出喉癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的microRNA及其靶基因作為分子靶標(biāo),以期建立喉癌早期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床分子預(yù)測(cè)、監(jiān)測(cè)機(jī)制,及早干預(yù),達(dá)到臨床防治喉癌復(fù)發(fā)、提高療效及改善患者預(yù)后的目的。本課題在規(guī)范化腫瘤標(biāo)本收集和保存的基礎(chǔ)上,采用基因芯片技術(shù)篩選分析與喉癌不良預(yù)后相關(guān)的microRNA及其靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證,以期尋找出可能的生物標(biāo)記物。研究主要分為以下幾部分。 第一章喉癌規(guī)范化標(biāo)本庫(kù)的建立與管理 目的：建立規(guī)范化的喉癌標(biāo)本庫(kù),為喉癌的科學(xué)研究提供高質(zhì)量的標(biāo)本,并進(jìn)行信息化管理。 方法：采集并保存喉癌組織和血標(biāo)本,定期提取部分標(biāo)本總RNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定,對(duì)病人進(jìn)行隨訪,收集喉癌病人臨床病理信息、標(biāo)本信息、生存狀況、復(fù)發(fā)情況、術(shù)后喉功能等資料并通過電腦軟件進(jìn)行信息化管理。 結(jié)果：從建立喉癌標(biāo)本庫(kù)至2012年12月,共成功收集147例配對(duì)的喉癌／癌旁正常組織標(biāo)本和82例血漿及血清標(biāo)本,質(zhì)量鑒定顯示標(biāo)本質(zhì)量良好。建立并完善了標(biāo)本的采集、處理、保存以及信息化管理的標(biāo)準(zhǔn)化流程。建立了喉癌病人全面、準(zhǔn)確的信息庫(kù),提高了標(biāo)本管理和使用的效率和準(zhǔn)確性。 結(jié)論：喉癌規(guī)范化標(biāo)本庫(kù)的建立對(duì)喉癌的研究具有重要的價(jià)值,有助于保護(hù)寶貴的生物醫(yī)學(xué)資源。標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)本采集、處理保存、信息化管理為喉癌研究提供了高質(zhì)量的標(biāo)本,保證其順利進(jìn)行發(fā)揮了關(guān)鍵作用。 第二章喉鱗癌患者手術(shù)治療后的預(yù)后因素回顧性分析 目的：探討影響喉鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后生存和預(yù)后的最重要因素。 方法：收集在廣東省人民醫(yī)院治療的205例接受喉全切除術(shù)、喉部分切除術(shù)或顯微喉鏡下C02激光切除術(shù)的喉鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床和隨訪資料,應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析,通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)影響患者預(yù)后的因素進(jìn)行多元回歸分析。 結(jié)果：腫瘤分型中,69.8%的病例為聲門型和30.2%為聲門上型。多數(shù)患者為NO(77.6%),22.4%的患者為N1-N3。超過半數(shù)患者為T1-T2期(55.1%),20.0%為T3期,24.9%為T4期。中位隨訪時(shí)間為49.2個(gè)月。術(shù)后第1,2,3年的生存率分別為99.0%,91.7%和81.5%。ⅣV期患者的生存率低于Ⅰ期和Ⅱl期者(分別為p0.001和p=0.013)。術(shù)后第1,2,3年的無進(jìn)展生存率分別為83.9%,74.6%和71.2%。而且,Charlson評(píng)分為1-2或≥3的患者相對(duì)Charlson評(píng)分為0者有更高的死亡率(HR分別為1.8和2.41,p=0.042和p=0.008)。多因素分析顯示臨床分期、外科切緣及同病與患者的死亡率和無疾病進(jìn)展生存率顯著相關(guān)。 結(jié)論:外科切緣、臨床分期及同病是影響喉癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素,晚期、切緣陽性者、嚴(yán)重同病患者的生存率顯著降低,提示了喉癌早診早治、獲得手術(shù)切緣陰性以及同病狀況對(duì)預(yù)后的重要性。 第三章利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)喉癌組織中差異表達(dá)的miRNAs目的：篩選并分析喉癌組織與周圍正常喉黏膜的微小RNA(micro-RNAs, miRNAs)之間的表達(dá)譜差異,為進(jìn)一步研究miRNA與喉癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供線索。方法：收集喉癌組織和癌旁正常喉黏膜標(biāo)本共10對(duì),應(yīng)用Invitrogen公司的TRIzol和QIAGEN公司的niRNeasy mini kit試劑盒抽提總RNA,使用nanodrop公司的分光光度計(jì)ND-1000測(cè)定RNA的質(zhì)量和定量,RNA的完整性由凝膠電泳判定。使用丹麥Exiqon公司的miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power labeling kit,進(jìn)行miRNA標(biāo)記。在熒光標(biāo)記后進(jìn)行雜交。用Axon GenePix4000B microarray scanner (Axon)進(jìn)行掃描。掃描得到的圖像輸入GenePix Pro6.0(Axon)軟件進(jìn)行坐標(biāo)調(diào)整和數(shù)據(jù)提取對(duì)喉癌中的niRNA差異表達(dá)進(jìn)行篩選。根據(jù)差異表達(dá)的比值,閾值大于2倍以上為上調(diào),小于0.5倍為下調(diào)。采用SAM軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。 結(jié)果：通過miRNA芯片篩選,我們得到了2662個(gè)差異表達(dá)的miRNA,將其中的非人類niRNA以及超過一半樣本無法檢測(cè)到的miRNA去除后,發(fā)現(xiàn)了780個(gè)miRNA有差異表達(dá),其中277個(gè)nicroRNA表達(dá)上調(diào),503個(gè)microRNA表達(dá)下調(diào)。我們對(duì)芯片分析結(jié)果獲得的780個(gè)miRNA進(jìn)一步采用SAM軟件分析,設(shè)定FDR為0.05,經(jīng)校正后在喉癌組織中共有11個(gè)miRNA表達(dá)顯著上調(diào)；114個(gè)miRNA表達(dá)顯著下調(diào)。 結(jié)論：1.基因芯片技術(shù)篩選喉癌特征性microRNA表達(dá)譜是可行的。2.對(duì)芯片結(jié)果的分析需注意統(tǒng)計(jì)學(xué)的多種檢驗(yàn)問題,因此應(yīng)做錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)校正。3.基因芯片結(jié)果存在一定假陽性,需其他方法進(jìn)一步驗(yàn)證。 第四章應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)對(duì)基因芯片結(jié)果 進(jìn)行驗(yàn)證 目的：驗(yàn)證基因芯片篩選結(jié)果的可靠性 方法：從32例喉癌病人的腫瘤及癌旁正常組織用TRIzol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,采用Sybr-Green染料法,以U6為內(nèi)參基因,對(duì)于芯片結(jié)果中顯著下調(diào)的microRNA中選取let-7f-5p、 miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p、miRNA-195-5p、miRNA-203的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。Bio-Rad CFX96Manager軟件分析,GraphPad軟件作圖。 結(jié)果：對(duì)let-7f-5p、miRNA-10a-5p、miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p. miRNA-195-5p、miRNA-203等6個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNAs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,這6個(gè)miRNA在32對(duì)喉癌與周圍正常喉黏膜組織之間的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義其中miRNA-125a-5p、miRNA-144-3p和miRNA-203最顯著。 結(jié)論：實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)的結(jié)果與基因芯片結(jié)果一致,基因芯片結(jié)果是可靠的。 第五章觀察篩選出的目標(biāo)microRNA對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞株增殖及轉(zhuǎn)移、侵襲的作用研究 目的：選取了在芯片實(shí)驗(yàn)中及qRT-PCR中已驗(yàn)證的顯著下調(diào)的miR-144-3p在喉癌細(xì)胞株Hep-2進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),觀察其對(duì)喉癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響及尋找其可能的靶基因。 方法：1.利用生物信息學(xué)查找出mir-144-3p的可能靶基因。2.應(yīng)用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù),通過MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期檢測(cè)觀察miR-144-3p對(duì)喉癌細(xì)胞的增殖的影響。3.通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、3D-Culture、劃痕實(shí)驗(yàn),觀察喉癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化。4.綜合運(yùn)用了qRT-PCR、Westemblot技術(shù)、GFP報(bào)告基因、雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)研究了喉癌細(xì)胞中miR-144-3p對(duì)于可能靶基因的調(diào)控作用。 結(jié)果：1.利用生物信息學(xué)查找出mir-144-3p的可能靶基因?yàn)镋TS-1。2.miR-144-3p可使喉癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力減弱。3.miR-144-3p可使ETS-1表達(dá)下調(diào)。4.miR-144-3p可使上皮分子標(biāo)志物(E-Cadherin, α-catenin)的表達(dá)升高,間質(zhì)分子標(biāo)志物(F ibronectin, Vimentin等)表達(dá)降低。 結(jié)論：1.miR-144-3p在喉癌組織中表達(dá)下調(diào),提示了其在喉癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。2.miR-144-3p可能是通過作用于其下游的靶基因ETS-1對(duì)喉癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移起抑制作用,同時(shí)miR-144-3p有抑制喉癌細(xì)胞的增值的作用。3.miR-144-3p可能是通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)影響喉癌Hep2細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移的。 第六章ETS-1的表達(dá)與喉鱗癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系 目的：觀察轉(zhuǎn)錄因子ETS-1在喉鱗癌組織中的表達(dá)；探討其在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及與預(yù)后的關(guān)系和意義。 方法：采集54例配對(duì)喉癌、癌旁正常組織及34例不典型增生石蠟組織標(biāo)本,采用免疫組織化學(xué)分別檢測(cè)其ETS-1的表達(dá),并對(duì)喉癌病人每三個(gè)月進(jìn)行隨訪,至少隨訪三年,收集喉癌病人臨床病理信息、生存狀況等資料。另外采集8例配對(duì)新鮮冰凍喉癌、癌旁正常組織,采用qRT-PCR及Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證ETS-1在喉癌中的表達(dá)變化。 結(jié)果：ETS-1在喉癌組織和不典型增生中呈表達(dá)陽性者均顯著高于癌旁正常組織(P0.001)。ETS-1的表達(dá)水平高低與臨床分期、T分期、甲狀軟骨受侵、病理分化顯著相關(guān)(P0.05),而與性別、年齡、N分期、腫瘤分型無關(guān)(P0.05)；ETS-1蛋白低表達(dá)的患者其總生存率要明顯高于ETS-1蛋白高表達(dá)患者。新鮮標(biāo)本中的qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ETS-1在喉鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)。 結(jié)論：ETS-1的高表達(dá)與喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后呈負(fù)相關(guān),但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1642460