本文選題：喉癌　切入點：OCT-4　出處：《鄭州大學》2010年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 喉癌是耳鼻喉科最常見的惡性腫瘤,由于喉癌生長部位的特殊性,且手術(shù)、放射和化學治療仍然存在并發(fā)癥多、毒副作用大的問題,給患者帶來較大的痛苦。因此,急需要在分子生物學的基礎(chǔ)上提出新的診斷方法和簡便、有效的治‘療手段,這已成為當前研究的熱點課題。 雖然腫瘤發(fā)病機制迄今尚不明了,但可以肯定的是腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多步驟、多階段和多基因參與并異常表達的過程。很多科研機構(gòu)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤中存在很小比例的具有干細胞特性的腫瘤細胞,稱其為瘤干細胞樣細胞(Cancer stem cell-like cells, CSCLC),研究者認為這些CSCLC在腫瘤的起源和發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用。雖然該學說目前的爭議較大,但是有一點可以明確的是,腫瘤細胞中應該存在某些調(diào)控自我更新的關(guān)鍵基因的異常表達,這是保證腫瘤細胞失控的、異常的、單克隆無限制增殖的基礎(chǔ)。 生物體內(nèi)有一系列信號分子維持著干細胞多能性,目前研究的最為廣泛是OCT-4。OCT-4基因是POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一個成員,在胚胎干細胞和成人干細胞上均有表達,參與胚胎發(fā)育過程中多向性分化的調(diào)節(jié),而且可以控制其無限增殖的特性。目前研究發(fā)現(xiàn)OCT-4不僅在多能性胚胎干細胞和原始生殖細胞中表達,在某些惡性生殖細胞腫瘤如精原細胞瘤、胚胎性癌及實體瘤內(nèi)也檢測到了OCT-4的異常表達。有關(guān)在喉鱗狀細胞癌中OCT-4的表達及其意義的研究,迄今國內(nèi)外鮮有報道。 為深入探討OCT-4基因與喉癌惡性生物學行為的關(guān)系,明確OCT-4在喉癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,尋求喉癌診斷、治療和預后指標及尋找抑制喉癌發(fā)生、發(fā)展的有效方法,本研究檢測了喉癌組織、癌旁正常組織及聲帶息肉組織中OCT-4的表達情況,探討了OCT-4與喉癌惡性生物學行為的關(guān)系。并構(gòu)建了攜帶OCT-4mRNA編碼區(qū)cDNA序列和siRNA序列的真核表達載體來研究OCT-4對喉癌Hep-2細胞增殖及p-STAT3/STAT3和Survivin表達水平的影響；檢測了丙戊酸鈉(VPA)對喉癌Hep-2細胞OCT-4、p-STAT3/STAT3和Survivin表達水平的影響；通過裸鼠移植瘤實驗進行體內(nèi)試驗,從多個方面深入探討OCT-4和VPA對喉癌Hep-2細胞的影響,試圖闡明OCT-4的表達在喉癌發(fā)生、發(fā)展中的意義；并進一步闡明OCT-4基因的抑制和VPA處理對喉癌Hep-2細胞增殖的抑制是否與下調(diào)STAT3蛋白磷酸化水平及Survivin的表達有關(guān)。為進一步探討喉癌發(fā)生、發(fā)展的機制及尋找抑制喉癌發(fā)生、發(fā)展的治療途徑提供理論基礎(chǔ)。本研究共分以下4章。 第一章：OCT-4和Survivin在喉鱗狀細胞癌組織中的表達及意義 方法 采用免疫組織化學、Real-time PCR和western的方法檢測77例喉癌組織、18例癌旁正常組織及15例聲帶息肉組織之中OCT-4和Survivin的表達情況。 結(jié)果 喉癌組織OCT-4和Survivin陽性表達高于癌旁正常組織和聲帶息肉組織,三種喉組織表達差異有統(tǒng)計學意義(P0.01);OCT-4陽性表達率與喉癌患者病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.01);Survivin陽性表達率與喉癌患者病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和T分期有關(guān)(P0.01)。且喉癌組織中OCT-4和Survivin的表達相互之間呈明顯的正相關(guān)(P0.05)。 第二章：OCT-4對喉癌Hep-2細胞影響的體外研究 方法 1.構(gòu)建攜帶人OCT-4基因mRNA編碼區(qū)全長cDNA序列和特異性siRNA序列的真核表達質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染并篩選出陽性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞克隆。 2.采用MTT和平板克隆法測定對照組和各轉(zhuǎn)染組Hep-2細胞增殖和克隆能力。 3.采用流式細胞術(shù)(FCM)測定對照組和各轉(zhuǎn)染組Hep-2細胞周期和凋亡的情況。 4.采用Real-time PCR和Western blot的方法檢測對照組和各轉(zhuǎn)染組Hep-2細胞p-STAT3/STAT3和Survivin表達的情況。 結(jié)果 1. pcDNA3.1-OCT-4和pSUPER-EGFP-OCT-4真核表達載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Hep-2細胞成功。 2.MTT實驗結(jié)果顯示：與對照組相比,pcDNA3.1-OCT-4-2組細胞增殖和克隆能力明顯增強(P0.01),而pSUPER-EGFP-OCT-4-c組細胞增殖和克隆能力明顯減弱(P0.01),pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空質(zhì)粒組則無明顯差異(P0.05)。 3.FCM結(jié)果顯示：與對照組相比,pcDNA3.1-OCT-4-2組G0/G1期細胞比例明顯減少(P0.01),S和G2/M期細胞比例升高(P0.05); pSUPER-EGFP-OCT-4-c組G0/G1期細胞比例明顯升高(P0.01),S和G2/M期細胞比例減少(P0.05),同時與各組相比其凋亡率增加；pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空質(zhì)粒組則無明顯差異(P0.05)。 4. Real-time PCR和western結(jié)果顯示：與對照組相比,pcDNA3.1-OCT-4-2組細胞p-STAT3蛋白、Survivin mRNA和蛋白表達升高,而在pSUPER-EGFP-OCT-4-c組表達降低(P0.01), pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空質(zhì)粒組表達則無明顯差異(P0.05)。 第三章：VPA對喉癌Hep-2細胞增殖作用的影響及機制研究 方法 1.采用MTT方法檢VPA作用后Hep-2細胞增殖活性的改變,計算其抑制率。 2.采用FCM檢測經(jīng)3mmol/L VPA作用0(對照組)、24、48、72h后Hep-2細胞細胞周期和凋亡情況。 3.采用Real-time PCR和western方法檢測經(jīng)3mmol/L VPA作用0(對照組)、24、48、72h后Hep-2細胞OCT-4、p-STAT3/STAT3和Survivin表達的情況。 結(jié)果： 1.MTT結(jié)果顯示：VPA對Hep-2細胞的生長抑制作用具有劑量和時間依賴性。 2.FCM結(jié)果顯示：經(jīng)3mmol/L VPA作用后,隨著時間的增加,G0/Gl期細胞比例逐漸升高(P0.01),S期細胞比例逐漸降低(P0.01),而G2/M期細胞比例無明顯變化(P0.05),細胞凋亡率呈時間依賴性逐漸增加。 3. Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示：經(jīng)3mmol/L VPA作用后,隨著時間的增加,OCT-4 mRNA和蛋白表達逐漸升高(P0.01), p-STAT3蛋白及Survivin mRNA和蛋白的表達逐漸降低(P0.01)。 第四章：OCT-4和VPA對喉癌Hep-2細胞裸鼠移植瘤的影響及機制研究 方法 1.建立人喉癌裸鼠移植瘤模型。分為對照組、pcDNA3.1-OCT-4-2組、pSUPER-EGFP-OCT-4-c組和VPA實驗組。每周測量瘤體大小,繪制腫瘤體積生長曲線。治療終止時處死小鼠,剝除腫瘤稱重,計算抑瘤率。 2.采用TUNEL法檢測各組裸鼠移植瘤組織中腫瘤細胞凋亡情況,統(tǒng)計細胞凋亡指數(shù)。 3.采用Real-time PCR和western檢測各組裸鼠移植瘤組織中OCT-4、p-STAT3/STAT3和Survivin表達情況。 Results 1. pcDNA3.1-OCT-4-2組裸鼠移植瘤體積顯著大于對照組裸鼠移植瘤體積,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P 0.05); pSUPER-EGFP-OCT-4-c組和VPA組裸鼠移植瘤體積顯著小于對照組裸鼠移植瘤體積,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2. TUNEL結(jié)果顯示pSUPER-EGFP-OCT-4-c組和VPA組裸鼠移植瘤組織中凋亡細胞與對照組相比明顯增多,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 3. pcDNA3.1-OCT-4-2組和VPA組裸鼠移植瘤OCT-4 mRNA和蛋白表達顯著高于對照組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01); pSUPER-EGFP-OCT-4-c組顯著低于對照組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。pcDNA3.1-OCT-4-2組裸鼠移植瘤p-STAT3蛋白及Survivin mRNA和蛋白表達顯著高于對照組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)；pSUPER-EGFP-OCT-4-c和VPA組顯著低于對照組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。STAT3蛋白在每一組都沒有明顯變化。 結(jié)論 1.OCT-4在喉癌組織中高表達,與喉癌的病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),與Survivin的表達相互之間呈明顯的正相關(guān)；OCT-4促進喉癌Hep-2細胞的增殖和克隆,當抑制其表達時會導致細胞增殖和克隆能力的減弱,阻滯細胞于G0/G1期,誘導凋亡；其機制與抑制p-STAT3和Survivin表達密切相關(guān)。 2.VPA可以抑制Hep-2細胞的增殖,阻滯細胞于G0/G1期,誘導凋亡。VPA可以下調(diào)p-STAT3和Survivin表達來抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。 3.體內(nèi)試驗與體外實驗結(jié)果相似,抑制OCT-4的表達或給與VPA處理均可通過下調(diào)p-STAT3和Survivin表達來抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
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【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R739.65

【參考文獻】

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1 黃品助;盧燦亮;李斌奎;洪健;黃亮;王莉;張穎;元云飛;;OCT4在肝細胞癌中的表達及其臨床意義[J];癌癥;2010年01期

2 秦薇;張曉偉;章莉;張鳳春;;Oct-4在胃癌組織中的表達及臨床意義[J];上海交通大學學報(醫(yī)學版);2009年06期

3 周一葉;曾凡一;;維持胚胎干細胞多能性和自我更新的轉(zhuǎn)錄因子Oct-4/Nanog以及相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡[J];遺傳;2008年05期

4 ;Silencing of signal transducer and activator of transcription 3 expression by RNA interference suppresses growth of human hepatocellular carcinoma in tumor-bearing nude mice[J];World Journal of Gastroenterology;2009年21期

5 ;Lentivirus-mediated shRNA interference targeting STAT3 inhibits human pancreatic cancer cell invasion[J];World Journal of Gastroenterology;2009年30期

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本文編號：1627376