本文選題：喉癌　切入點(diǎn)：OCT-4　出處：《鄭州大學(xué)》2010年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】： 喉癌是耳鼻喉科最常見(jiàn)的惡性腫瘤,由于喉癌生長(zhǎng)部位的特殊性,且手術(shù)、放射和化學(xué)治療仍然存在并發(fā)癥多、毒副作用大的問(wèn)題,給患者帶來(lái)較大的痛苦。因此,急需要在分子生物學(xué)的基礎(chǔ)上提出新的診斷方法和簡(jiǎn)便、有效的治‘療手段,這已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)課題。 雖然腫瘤發(fā)病機(jī)制迄今尚不明了,但可以肯定的是腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多步驟、多階段和多基因參與并異常表達(dá)的過(guò)程。很多科研機(jī)構(gòu)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤中存在很小比例的具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞,稱(chēng)其為瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(Cancer stem cell-like cells, CSCLC),研究者認(rèn)為這些CSCLC在腫瘤的起源和發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。雖然該學(xué)說(shuō)目前的爭(zhēng)議較大,但是有一點(diǎn)可以明確的是,腫瘤細(xì)胞中應(yīng)該存在某些調(diào)控自我更新的關(guān)鍵基因的異常表達(dá),這是保證腫瘤細(xì)胞失控的、異常的、單克隆無(wú)限制增殖的基礎(chǔ)。 生物體內(nèi)有一系列信號(hào)分子維持著干細(xì)胞多能性,目前研究的最為廣泛是OCT-4。OCT-4基因是POU轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)成員,在胚胎干細(xì)胞和成人干細(xì)胞上均有表達(dá),參與胚胎發(fā)育過(guò)程中多向性分化的調(diào)節(jié),而且可以控制其無(wú)限增殖的特性。目前研究發(fā)現(xiàn)OCT-4不僅在多能性胚胎干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞中表達(dá),在某些惡性生殖細(xì)胞腫瘤如精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌及實(shí)體瘤內(nèi)也檢測(cè)到了OCT-4的異常表達(dá)。有關(guān)在喉鱗狀細(xì)胞癌中OCT-4的表達(dá)及其意義的研究,迄今國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。 為深入探討OCT-4基因與喉癌惡性生物學(xué)行為的關(guān)系,明確OCT-4在喉癌發(fā)生、發(fā)展中的作用,尋求喉癌診斷、治療和預(yù)后指標(biāo)及尋找抑制喉癌發(fā)生、發(fā)展的有效方法,本研究檢測(cè)了喉癌組織、癌旁正常組織及聲帶息肉組織中OCT-4的表達(dá)情況,探討了OCT-4與喉癌惡性生物學(xué)行為的關(guān)系。并構(gòu)建了攜帶OCT-4mRNA編碼區(qū)cDNA序列和siRNA序列的真核表達(dá)載體來(lái)研究OCT-4對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖及p-STAT3/STAT3和Survivin表達(dá)水平的影響；檢測(cè)了丙戊酸鈉(VPA)對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞OCT-4、p-STAT3/STAT3和Survivin表達(dá)水平的影響；通過(guò)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn),從多個(gè)方面深入探討OCT-4和VPA對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞的影響,試圖闡明OCT-4的表達(dá)在喉癌發(fā)生、發(fā)展中的意義；并進(jìn)一步闡明OCT-4基因的抑制和VPA處理對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖的抑制是否與下調(diào)STAT3蛋白磷酸化水平及Survivin的表達(dá)有關(guān)。為進(jìn)一步探討喉癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制及尋找抑制喉癌發(fā)生、發(fā)展的治療途徑提供理論基礎(chǔ)。本研究共分以下4章。 第一章：OCT-4和Survivin在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義 方法 采用免疫組織化學(xué)、Real-time PCR和western的方法檢測(cè)77例喉癌組織、18例癌旁正常組織及15例聲帶息肉組織之中OCT-4和Survivin的表達(dá)情況。 結(jié)果 喉癌組織OCT-4和Survivin陽(yáng)性表達(dá)高于癌旁正常組織和聲帶息肉組織,三種喉組織表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);OCT-4陽(yáng)性表達(dá)率與喉癌患者病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P0.01);Survivin陽(yáng)性表達(dá)率與喉癌患者病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和T分期有關(guān)(P0.01)。且喉癌組織中OCT-4和Survivin的表達(dá)相互之間呈明顯的正相關(guān)(P0.05)。 第二章：OCT-4對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞影響的體外研究 方法 1.構(gòu)建攜帶人OCT-4基因mRNA編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA序列和特異性siRNA序列的真核表達(dá)質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染并篩選出陽(yáng)性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆。 2.采用MTT和平板克隆法測(cè)定對(duì)照組和各轉(zhuǎn)染組Hep-2細(xì)胞增殖和克隆能力。 3.采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測(cè)定對(duì)照組和各轉(zhuǎn)染組Hep-2細(xì)胞周期和凋亡的情況。 4.采用Real-time PCR和Western blot的方法檢測(cè)對(duì)照組和各轉(zhuǎn)染組Hep-2細(xì)胞p-STAT3/STAT3和Survivin表達(dá)的情況。 結(jié)果 1. pcDNA3.1-OCT-4和pSUPER-EGFP-OCT-4真核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞成功。 2.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,pcDNA3.1-OCT-4-2組細(xì)胞增殖和克隆能力明顯增強(qiáng)(P0.01),而pSUPER-EGFP-OCT-4-c組細(xì)胞增殖和克隆能力明顯減弱(P0.01),pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空質(zhì)粒組則無(wú)明顯差異(P0.05)。 3.FCM結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,pcDNA3.1-OCT-4-2組G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少(P0.01),S和G2/M期細(xì)胞比例升高(P0.05); pSUPER-EGFP-OCT-4-c組G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高(P0.01),S和G2/M期細(xì)胞比例減少(P0.05),同時(shí)與各組相比其凋亡率增加；pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空質(zhì)粒組則無(wú)明顯差異(P0.05)。 4. Real-time PCR和western結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,pcDNA3.1-OCT-4-2組細(xì)胞p-STAT3蛋白、Survivin mRNA和蛋白表達(dá)升高,而在pSUPER-EGFP-OCT-4-c組表達(dá)降低(P0.01), pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空質(zhì)粒組表達(dá)則無(wú)明顯差異(P0.05)。 第三章：VPA對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖作用的影響及機(jī)制研究 方法 1.采用MTT方法檢VPA作用后Hep-2細(xì)胞增殖活性的改變,計(jì)算其抑制率。 2.采用FCM檢測(cè)經(jīng)3mmol/L VPA作用0(對(duì)照組)、24、48、72h后Hep-2細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡情況。 3.采用Real-time PCR和western方法檢測(cè)經(jīng)3mmol/L VPA作用0(對(duì)照組)、24、48、72h后Hep-2細(xì)胞OCT-4、p-STAT3/STAT3和Survivin表達(dá)的情況。 結(jié)果： 1.MTT結(jié)果顯示：VPA對(duì)Hep-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。 2.FCM結(jié)果顯示：經(jīng)3mmol/L VPA作用后,隨著時(shí)間的增加,G0/Gl期細(xì)胞比例逐漸升高(P0.01),S期細(xì)胞比例逐漸降低(P0.01),而G2/M期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化(P0.05),細(xì)胞凋亡率呈時(shí)間依賴(lài)性逐漸增加。 3. Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示：經(jīng)3mmol/L VPA作用后,隨著時(shí)間的增加,OCT-4 mRNA和蛋白表達(dá)逐漸升高(P0.01), p-STAT3蛋白及Survivin mRNA和蛋白的表達(dá)逐漸降低(P0.01)。 第四章：OCT-4和VPA對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞裸鼠移植瘤的影響及機(jī)制研究 方法 1.建立人喉癌裸鼠移植瘤模型。分為對(duì)照組、pcDNA3.1-OCT-4-2組、pSUPER-EGFP-OCT-4-c組和VPA實(shí)驗(yàn)組。每周測(cè)量瘤體大小,繪制腫瘤體積生長(zhǎng)曲線。治療終止時(shí)處死小鼠,剝除腫瘤稱(chēng)重,計(jì)算抑瘤率。 2.采用TUNEL法檢測(cè)各組裸鼠移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞凋亡情況,統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡指數(shù)。 3.采用Real-time PCR和western檢測(cè)各組裸鼠移植瘤組織中OCT-4、p-STAT3/STAT3和Survivin表達(dá)情況。 Results 1. pcDNA3.1-OCT-4-2組裸鼠移植瘤體積顯著大于對(duì)照組裸鼠移植瘤體積,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05); pSUPER-EGFP-OCT-4-c組和VPA組裸鼠移植瘤體積顯著小于對(duì)照組裸鼠移植瘤體積,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2. TUNEL結(jié)果顯示pSUPER-EGFP-OCT-4-c組和VPA組裸鼠移植瘤組織中凋亡細(xì)胞與對(duì)照組相比明顯增多,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 3. pcDNA3.1-OCT-4-2組和VPA組裸鼠移植瘤OCT-4 mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01); pSUPER-EGFP-OCT-4-c組顯著低于對(duì)照組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。pcDNA3.1-OCT-4-2組裸鼠移植瘤p-STAT3蛋白及Survivin mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；pSUPER-EGFP-OCT-4-c和VPA組顯著低于對(duì)照組,組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。STAT3蛋白在每一組都沒(méi)有明顯變化。 結(jié)論 1.OCT-4在喉癌組織中高表達(dá),與喉癌的病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),與Survivin的表達(dá)相互之間呈明顯的正相關(guān)；OCT-4促進(jìn)喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖和克隆,當(dāng)抑制其表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖和克隆能力的減弱,阻滯細(xì)胞于G0/G1期,誘導(dǎo)凋亡；其機(jī)制與抑制p-STAT3和Survivin表達(dá)密切相關(guān)。 2.VPA可以抑制Hep-2細(xì)胞的增殖,阻滯細(xì)胞于G0/G1期,誘導(dǎo)凋亡。VPA可以下調(diào)p-STAT3和Survivin表達(dá)來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。 3.體內(nèi)試驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,抑制OCT-4的表達(dá)或給與VPA處理均可通過(guò)下調(diào)p-STAT3和Survivin表達(dá)來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

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1 黃品助;盧燦亮;李斌奎;洪健;黃亮;王莉;張穎;元云飛;;OCT4在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義[J];癌癥;2010年01期

2 秦薇;張曉偉;章莉;張鳳春;;Oct-4在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年06期

3 周一葉;曾凡一;;維持胚胎干細(xì)胞多能性和自我更新的轉(zhuǎn)錄因子Oct-4/Nanog以及相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[J];遺傳;2008年05期

4 ;Silencing of signal transducer and activator of transcription 3 expression by RNA interference suppresses growth of human hepatocellular carcinoma in tumor-bearing nude mice[J];World Journal of Gastroenterology;2009年21期

5 ;Lentivirus-mediated shRNA interference targeting STAT3 inhibits human pancreatic cancer cell invasion[J];World Journal of Gastroenterology;2009年30期

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本文編號(hào)：1627376