發(fā)布時間：2018-03-11 21:10

  本文選題：GnT-V　切入點(diǎn)：RNAi　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、研究背景 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我國常見的惡性腫瘤,好發(fā)于華南方地區(qū),其發(fā)病有明顯的種族地區(qū)和家族地區(qū)聚集現(xiàn)象。據(jù)估計,世界上80%的鼻咽癌發(fā)生于我國。鼻咽癌發(fā)病率占頭頸部腫瘤的首位,發(fā)病年齡在3-84歲之間,以30-50歲多見,男性發(fā)病為女性的2-3倍。鼻咽癌已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅我國人民生命和健康的十大惡性腫瘤之一。 鼻咽癌多屬低分化鱗狀細(xì)胞癌,大多數(shù)對放射治療有中度敏感性,其鄰近結(jié)構(gòu)對放射線亦有較高的耐受性,因此,目前治療鼻咽癌的主要手段是放射治療結(jié)合全身化療。但臨床發(fā)現(xiàn)患者的放射敏感性存在個體差異,導(dǎo)致治療效果亦出現(xiàn)很大的不同。影響腫瘤細(xì)胞放射敏感性的因素很多,細(xì)胞凋亡是重要因素之一。自1972年Kerr發(fā)現(xiàn)自然界存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象以來,人們對凋亡的認(rèn)識不斷加深,并陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了如Bcl-2等一系列的凋亡調(diào)控基因,同時也促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究。 糖基化是真核生物細(xì)胞表面常見的翻譯后產(chǎn)物修飾反應(yīng)中的一種。糖蛋白中的糖鏈直接影響著糖蛋白生物功能的發(fā)揮。蛋白的寡糖鏈參與了分子識別以及細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與間質(zhì)間的識別、黏附和受體作用等多種生物功能。糖鏈表達(dá)量及結(jié)構(gòu)的改變是普遍的惡行生物行為。細(xì)胞癌變時癌細(xì)胞膜上糖蛋白的寡糖鏈發(fā)生改變,即糖基異�；�(aberrantglycosylation),各種異常糖蛋白糖基可影響細(xì)胞的正常功能,如細(xì)胞識別和黏附功能障礙,是導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的分子基礎(chǔ)研究。而異常糖基化常因腫瘤細(xì)胞高爾基體上的糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)水平改變所致。N-糖鏈分支增多常與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān),如N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(GnT-Ⅴ, Mgat5,能夠催化形成形成β1,6-乙酰氨基葡糖分支結(jié)構(gòu))。許多研究以表明,GnT-Ⅴ活性增高以及其糖基化產(chǎn)物增多與細(xì)胞活力、浸潤能力、以及轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。GnT-Ⅴ活性在許多惡性腫瘤組織中表達(dá)增高,如乳腺癌、肝癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、膽管癌以及鼻咽癌等,但是在非小細(xì)胞肺癌中惡性程度越高,其表達(dá)量越低。 關(guān)于RNA干擾(RNA interfering, RNAi)現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引發(fā)的廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。細(xì)胞中的核糖核酸酶Ⅲ家族成員之一的,dsRNA特異性的核酸酶Dicer將dsRNA裂解成由21-25個核苷酸組成的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA),隨后si RNA作為介導(dǎo)子引起特異性地降解相同序列的mRNA,從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。 腫瘤分子靶向治療是指在腫瘤分子細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)上,利用腫瘤組織或細(xì)胞所具有的特異性(或相對特異的)結(jié)構(gòu)分子作為靶點(diǎn),使用某些能與這些靶分子特異結(jié)合的抗體、配體等達(dá)到直接治療或?qū)蛑委熌康牡囊活惎煼�。分子靶向藥物以某些腫瘤細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)的分子為作用靶點(diǎn),從而能夠更加特異性地作用于特定腫瘤細(xì)胞,阻斷其生長、轉(zhuǎn)移或誘導(dǎo)其凋亡,抑制或殺死腫瘤細(xì)胞,達(dá)到控制腫瘤的目的。 二、研究目的 鼻咽癌是我國的高發(fā)腫瘤,目前關(guān)于GnT-Ⅴ表達(dá)與鼻咽癌關(guān)系的相關(guān)研究較少,本試驗(yàn)利用RNAi原理及技術(shù),合成針對多數(shù)腫瘤細(xì)胞鼻咽癌中高表達(dá)基因GnT-Ⅴ的shRNA表達(dá)質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2,觀察GnT-Ⅴ的表達(dá)變化對鼻咽癌細(xì)胞株體內(nèi)增殖及轉(zhuǎn)移能力的影響。目的就在于能否在鼻咽癌的分子靶向治療中找到一個新的靶點(diǎn),并提供客觀試驗(yàn)依據(jù)。 三、實(shí)驗(yàn)方法 1、GnT-ⅤshRNA質(zhì)粒制備：由上海吉瑪公司完成。 2、細(xì)胞培養(yǎng)：轉(zhuǎn)染成功的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2/NC、CEN-2/2224在37℃5%CO_2條件下,培養(yǎng)于含10%新生牛血清及2000ug/ml G418的RPMI-1640中,每周傳代2～3次。CNE-2細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期。 3、裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×107/mL,按100μL/只進(jìn)行臀部皮下注射。左臀部：陰性對照組(CNE-2/NC),右臀部：干擾組(CNE-2/2224)。每組4只。在2周內(nèi)每隔2天測量瘤體的長徑、短徑,觀察瘤體體積大小變化。瘤體體積=短徑2×長徑/2。 4、肝臟異位種植肺轉(zhuǎn)移裸鼠模型 每組5只裸鼠,10%水合氯醛100μL/只行腹腔內(nèi)麻醉。取對數(shù)生長期的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/mL,按50μL/只進(jìn)行肝臟注射。其后繼續(xù)在SPF條件下飼養(yǎng)。接種后2周處死裸鼠,打開腹腔,肉眼觀察肝臟有無癌灶、肺臟有無轉(zhuǎn)移灶,所有肝臟種植瘤及轉(zhuǎn)移瘤均經(jīng)病理切片HE染色,了解有無瘤體形成；并用Real Time RT-PCR、Western blot、免疫組化檢測GnT-ⅤmRNA、蛋白表達(dá)水平有無改變；以及免疫組化檢測E-cadherin及bcl-2的表達(dá)情況。 (1) Real Time RT-PCR測定肝臟種植瘤中GnT-Ⅴ的mRNA表達(dá)情況 用Trizol提取肝臟種植瘤組織總RNA,采用AMV逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA. GnT-V上游引物為5'GAGCAGATCCTGGACCTCAG 3',下游引物為5’GCTGTCATGACTCCAGCGTA 3'。使用β-actin作為內(nèi)參,上游引物為5'GAAACTACCTTCAACTCCATC 3'下游引物為5'CGAGGCC AGGATGGAGCCGCC3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3Os, PCR: 94℃5s, 60℃30s,共40個循環(huán),溶解曲線：95℃0s,65℃60s,95℃0s. 基于目的基因和看家基因?qū)崟r熒光定量擴(kuò)增曲線得到Ct(C為Cycle, t為threshold)值,△CT代表目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)強(qiáng)度,公式為△CT=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。用Folds= 2-ΔΔCt表示實(shí)驗(yàn)組目的基因與對照組目的基因表達(dá)量的倍比關(guān)系,ΔΔCt=ΔCT實(shí)驗(yàn)組-△CT對照組。目的基因?yàn)镚nT-Ⅴ,內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。 (2) Western blot檢測GnT-Ⅴ蛋白表達(dá) 提取肝臟種植瘤總蛋白,用測定蛋白濃度,吸取50μg總蛋白,去離子水補(bǔ)至20μL,加入等體積2×上樣buffer煮沸7min,離心后吸取30μL上樣,經(jīng)不連續(xù)SDS-PAGE電泳分離后,用半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉37℃封閉2h, TBST洗膜后,將目的條帶以及內(nèi)參條帶分別用羊抗人GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗體(1：200)、鼠抗人GAPDH蛋白單克隆抗體(1：1000)4℃孵育過夜,洗膜后分別加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG (1:500)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1：5000),室溫下?lián)u動1h,洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測,暗室曝光X線片,沖洗膠片,UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像,Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值,用GnT-Ⅴ/GAPDH代表GnT-Ⅴ的相對表達(dá)量。 (3)HE染色 取肝臟組織、肺臟組織塊投入固定液中(10%福爾馬林),在低濃度到高濃度酒精中脫水,逐漸脫去組織塊中的水份。再將組織塊置于二甲苯中透明,浸蠟包埋。切片與貼片,脫蠟后用蘇木精、伊紅染色,脫水透明后樹膠封固。 (4)免疫組化 石蠟切片脫蠟和水化后,對組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。切片加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑,室溫下孵育10分鐘,加動物非免疫血清(兔／鼠),室溫下孵育20分鐘。除去血清,每張切片加一滴一抗(GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗體(1：200)、E-Caderin單克隆抗體(1：200)、Bcl-2單克隆抗體(1：300)),室溫下孵育60分鐘。切片加生物素標(biāo)記的兔抗羊IgG,室溫下孵育10分鐘。除去PBS液,每張切片加鏈霉菌抗生素蛋白—過氧化酶,室溫下孵育10分鐘。沖洗后滴新鮮配制的DAB溶液,顯微鏡下觀察。自來水沖洗,蘇木素復(fù)染。 (5)生存分析 每組取8只裸鼠,建立肝臟異位種植肺轉(zhuǎn)移裸鼠模型(具體方法同前),記錄每只裸鼠的生存天數(shù)。 6、統(tǒng)計學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均經(jīng)SPSS13.0軟件統(tǒng)計。計量資料統(tǒng)計分析結(jié)果用(X±S)表示,兩組肝臟種植瘤瘤體組織中GnT-ⅤmRNA和蛋白水平均采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；皮下成瘤試驗(yàn)瘤體體積采用重復(fù)測量的方差分析,組內(nèi)比較采用one-way ANOVA分析,組內(nèi)的多重比較采用LSD法,兩組間的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；兩組生存時間的比較采用Kaplan-Merer法分析。以P0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。 四、結(jié)果 1、皮下成瘤試驗(yàn)顯示,4天后可見2組裸鼠皮下均有瘤體形成,隨著時間延長,皮下瘤體不斷增大(F=528.871,P=0.000),兩組的平均體積分別是85.204mm3、139.860mm3, CNE-2 GnT-Ⅴ/2224組細(xì)胞形成瘤體體積小于CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組,體積數(shù)據(jù)及曲線均顯示CNE-2 GnT-Ⅴ/2224組瘤體體積增大的速度較CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組慢。與CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組相比,CNE-2 GnT-Ⅴ/2224組的平均抑瘤率為24.0%。 2、在第14天處死裸鼠時,CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組裸鼠的肝臟肉眼可見長徑為0.5～1.0cm的灰白色種植瘤,其中1只出現(xiàn)肝臟溶解性改變；而CNE-2 GnT-Ⅴ/2224組肉眼未見明顯的種植瘤。HE染色證明兩組裸鼠肝臟種植瘤處均有腫瘤細(xì)胞。2組裸鼠的肺臟,肉眼均未見明顯轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),但在CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組均出現(xiàn)大量胸腔積血。HE染色結(jié)果顯示：CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組可見腫瘤細(xì)胞,而CNE-2 GnT-Ⅴ/2224組未見明顯的腫瘤細(xì)胞。兩組的GnT-Ⅴ在mRNA、蛋白水平上均有顯著性差異(t=43.873, P=0.001;t=70.838, P=0.000)。實(shí)驗(yàn)組mRNA水平的平均抑制率為68.3%,蛋白水平的平均抑制率為63.7%。 3、肝臟種植瘤免疫組化顯示：Bcl-2蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿,CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組Bcl-2蛋白表達(dá)量較CNE-2 GnT-Ⅴ/2224組強(qiáng),E-鈣粘蛋白表達(dá)與細(xì)胞膜,2組在表達(dá)量上無明顯差異。 4、CNE-2 GnT-Ⅴ/NC組與CNE-2 GnT-Ⅴ/2224組的中位生存時間分別是18天,19天,二組在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異(x2=0.191,P=0.662)。 五、結(jié)論 1、沉默鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2中GnT-Ⅴ基因后,在體內(nèi)種植瘤中GnT-Ⅴ的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低。 2、沉默CNE-2中GnT-Ⅴ基因,細(xì)胞在體內(nèi)增殖能力受到抑制。 3、沉默CNE-2中GnT-Ⅴ基因,體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移能力受到抑制,裸鼠中位生存時間相對延長。 4、沉默CNE-2中GnT-Ⅴ基因,細(xì)胞在體內(nèi)的bcl-2表達(dá)水平下降,而E-cadherin未見明顯改變。 5、GnT-Ⅴ可能成為治療鼻咽癌的有效靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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4 莫穎禧;黃光武;;細(xì)胞黏附分子在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用[J];中國癌癥防治雜志;2010年02期

5 蘇劍敏,周逸平,徐薇苓,曹立環(huán),查錫良;E-鈣粘蛋白在四種腫瘤中表達(dá)的比較[J];中華腫瘤雜志;2000年03期

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本文編號：1599909