本文選題：下咽鱗狀細胞癌　切入點：自噬　出處：《山東大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：下咽鱗狀細胞癌(hypopharyngeal squamous cell carcinoma, HSCC)是頭頸部較常見的一種惡性腫瘤,發(fā)病率約占頭頸癌的5%。早期癥狀主要表現(xiàn)為咽部異物感、吞咽梗阻感,隨著瘤體增大,表面發(fā)生破潰,可引起吞咽疼痛、并出現(xiàn)同側反射性耳痛,常伴有進行性吞咽困難,累及喉腔可引起聲音嘶啞、呼吸困難等癥狀。因下咽癌中95%以上為鱗狀細胞癌,大多數(shù)分化程度較差,易粘膜下浸潤擴散,早期臨床癥狀不明顯,所以,在臨床就診時多數(shù)患者的病變已累及舌根、喉腔和頸段食道等部位,并多伴有頸部淋巴結轉移。近年來隨著頭頸外科診療技術的不斷發(fā)展,多種不同方法例如手術治療、放射治療、化療藥物治療以及三種療法相結合綜合抗癌治療的應用,HSCC患者生存率有所改善,但Ⅲ-Ⅳ期患者5年生存率仍僅為25%-40%。因此,深入研究HSCC的生物學特征,并在此基礎上尋找腫瘤特異性標志物以及探索新的診療方法成為目前亟須解決的課題。 自噬(autophagy)是細胞漿中出現(xiàn)大量由細胞膜包裹著部分胞質和細胞器的空泡結構(自噬體),溶酶體對空泡內(nèi)的成分進行消化降解,并轉變?yōu)闄C體所需的能量物質從而循環(huán)再利用的一種生物學現(xiàn)象。目前自噬至少可以分為三種形式,分別是微自噬、巨自噬和分子伴侶介導的自噬,通常我們所指的自噬為巨自噬。近年來研究表明自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉歸過程中發(fā)揮著重要的作用,其對腫瘤細胞的影響及其分子機制一直存在著爭議,自噬可在營養(yǎng)剝奪的條件下促進細胞的存活,起到保護細胞的作用,但在一定刺激條件下自噬被誘導時卻可導致細胞死亡。 目前在酵母中已經(jīng)鑒別出大約30個特定基因參與自噬調控,其中人類同源的有16個,在這些基因中, Beclin1和LC3(microtubule-associated protein1A/1B-lightchain3,微管相關蛋白1輕鏈3)在哺乳動物細胞自噬過程中起著關鍵的作用。Beclin1是酵母Atg6/Vps30基因在哺乳動物中的同源類似物,主要通過與ClassIIIPI3K形成復合物參與自噬體的形成。Liang等人報道了在乳腺癌組織中Beclin1表達水平顯著降低,將Beclin1轉染人乳腺癌MCF7細胞株造成Beclin1穩(wěn)定高表達,從而抑制癌細胞體外增殖活性,在體內(nèi)試驗中裸鼠成瘤能力也明顯受到抑制,因此,Beclin1在人乳腺癌中具有抑癌作用。Clelia等研究揭示了在人惡性黑色素瘤細胞中Beclin1蛋白表達水平較正常皮膚黑素細胞顯著降低。此外,Beclin1表達下調預示著自噬缺陷,與肝癌的惡性表型和預后不良密切相關。在卵巢癌、肺癌和腦神經(jīng)膠質瘤等實體瘤中同樣也存在Beclin1等位基因的缺失。但是,在已觀察到的95%腸癌和83%胃癌中Beclin1表達水平卻明顯增高,具有致癌的作用,由此可見Beclin1在不同腫瘤中發(fā)揮的作用各不相同。 LC3(microtubule-associated protein1A/1B-light chain3,微管相關蛋白1輕鏈3)是酵母Atg8基因在哺乳動物細胞中的同源物,經(jīng)Atg7和Atg3調節(jié)由泛素樣加工修飾。LC3有三種亞型,包括LC3A、LC3B和LC3C, LC3由可溶型LC3-Ⅰ和脂化型LC3-Ⅱ組成,其分子量分別18kd和16kd。在面臨各種應激情況下,例如缺氧、饑餓和化學藥物作用下,細胞自噬被誘導,LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工和修飾,與膜表面的脂酰乙醇胺(PE)相結合成LC3-Ⅱ,其中LC3-Ⅰ存在于細胞漿,脂化的LC3-Ⅱ與自噬泡相結合,定位于胞內(nèi)前自噬泡和自噬體膜表面。因此,LC3-II的含量與自噬泡的數(shù)量成正比,當細胞發(fā)生自噬時,LC3-Ⅱ上調。目前通過檢測胞內(nèi)LC3-Ⅱ表達的變化,從而可以判斷自噬的狀態(tài),LC3-Ⅱ已被作為監(jiān)測自噬活性的特異性標志物。Aoki等報道了Anti-LC3B抗體可以作為檢測腦膠質母細胞瘤細胞系和組織中自噬的有效工具。近年來研究發(fā)現(xiàn)LC3在肺癌和宮頸鱗狀細胞癌中呈現(xiàn)低表達并與患者預后不良相關,在這些腫瘤中LC3主要發(fā)揮抑癌作用。但在食道和胃腸道惡性腫瘤中LC3表達水平顯著增高,提示可能起到促癌的作用。提示LC3在不同腫瘤中發(fā)揮的作用具有組織特異性。 目前尚沒有關于自噬相關基因在HSCC中表達及其作用的研究,在本項課題中,我們分別從mRNA、蛋白水平檢測了自噬相關基因Beclin1、LC3在HSCC腫瘤組織和癌旁非腫瘤粘膜組織中的表達情況,并對病人進行追蹤和術后隨訪,進一步分析研究Beclin1、LC3表達與下咽癌臨床分期、病理分型以及疾病預后之間的關系。利用小干擾RNA技術在人下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞系中敲掉Beclin1,體外檢測自噬相關基因Beclin1低表達對FaDu細胞凋亡、增殖和轉移侵襲能力的影響。 第一部分下咽鱗狀細胞癌中自噬相關基因Beclinl和LC3的表達及其臨床意義 研究目的： 研究自噬相關基因Beclin1和LC3在下咽鱗狀細胞癌中的表達情況,并分析Beclin1和LC3表達與患者臨床病理特征以及預后之間的關系。 實驗方法 1.手術中收集82例HSCC腫瘤組織樣本和54例距腫瘤手術切緣2cm以上形態(tài)學正常的癌旁非腫瘤粘膜上皮組織樣本。 2.采用免疫組織化學染色方法檢測Beclin1和LC3分別在82例腫瘤樣本和54例癌旁非腫瘤粘膜樣本中的表達。 3. TRIzol法用來提取54對相互配對的腫瘤組織和癌旁非腫瘤粘膜組織中總RNA,并反轉錄為cDNA,利用Real-time PCR方法比較在配對樣本中Beclin1.. LC3mRNA水平上的表達差異。 4.使用蛋白裂解液從組織樣品中提取總蛋白,應用Western Blot方法在蛋白水平上定量檢測Beclin1和LC3在腫瘤組織和相對照的癌旁非腫瘤粘膜組織中的表達情況。 5.應用GraphPad Prism5.0和SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件。Beclin1和LC3相對表達量用mean±SEM表示,配對Wilcoxon符號秩和檢驗被應用于比較腫瘤組織與配對癌旁非腫瘤粘膜組織中Beclin1和LC3表達的差異。應用Spearman檢驗腫瘤組織中Beclin1和LC3之間的相關性,Beclin1、LC3的表達與HSCC臨床病理特征之間關系的分析采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。采用非參數(shù)Kaplan-Meier分析法繪制生存曲線,其差異分析采用log-rank檢驗。應用多因素Cox回歸模型分析影響HSCC患者生存時間的獨立危險因素。所有統(tǒng)計學分析均為雙側,P0.05時表示差異具有統(tǒng)計學意義。實驗結果： 1.免疫組織化學染色結果顯示Beclin1陽性表達見于細胞膜和細胞質,但主要表達在細胞膜。LC3陽性表達主要在細胞質和細胞核,極少量表達在細胞膜。Beclin1在79.6%(43/54)的癌旁非腫瘤粘膜組織中表達陽性,但僅在42.7%(35/82)的腫瘤組織樣本中陽性表達(P0.0001)。LC3在74.1%(40/54)的癌旁非腫瘤粘膜組織樣本中高表達,而僅在41.5%(34/82)的腫瘤組織樣本中呈現(xiàn)出高表達(P=0.0002)。Beclin1和LC3在HSCC腫瘤組織中的表達顯著低于相對照的癌旁非腫瘤粘膜組織。 2. Real-time PCR結果顯示Beclin1mRNA水平在腫瘤組織中相對表達量為(0.016±0.004),明顯低于配對的癌旁非腫瘤粘膜組織(0.024±0.005,P0.0001)。LC3-Ⅱ mRNA水平在腫瘤組織和癌旁非腫瘤粘膜組織中相對表達量均值分別為(0.154±0.053)和(0.242±0.083),統(tǒng)計學分析表明：與癌旁非腫瘤粘膜組織相比,LC3-Ⅱ mRNA水平在腫瘤組織中的表達顯著降低(P=0.0001)。此外Beclin1和LC3-Ⅱ在腫瘤組織中存在正相關性(r=0.51,P0.0001；95%CI：0.273to0.689)。 3. Western blot結果表明Beclin1在腫瘤組織樣本中蛋白水平的相對表達量為(0.308±0.031),明顯低于在癌旁非腫瘤粘膜組織中的表達(0.569±0.068,P＝0.02)。LC3-Ⅱ蛋白水平在腫瘤組織中的相對表達量是(0.289±0.034),顯著低于相對照的非腫瘤粘膜組織(0.685±0.076,P=0.004)。 4.Beclin1陰性表達與腫瘤高等級的臨床分期(r=0.299,P＝0.005)、腫瘤大小(r=0.365,P=0.0004)、較低的分化程度(r=0.392,P＝0.0006)和頸部淋巴結轉移(r=0.302,P＝0.004)有關。LC3低表達與腫瘤的大小(r=0.245,P=0.022)、較低的分化程度(r=0.504,P0.0001)和頸部淋巴結轉移(r=0.275,P=0.01)有關系。 5. Beclin1陰性表達病例組總體生存率顯著低于其陽性表達病例組(P0.0001),LC3低表達組患者總體生存率相比于LC3高表達組顯著降低(P=0.0145)。單因素Cox回歸模型分析結果顯示腫瘤的臨床分期(P=0.0009)、頸部淋巴結轉移(P=0.0007)、腫瘤大小(P＝0.0038)以及Beclin1的表達(P0.0001)、LC3表達水平(P=0.018)均與總體生存率有關。采用多因素Cox回歸模型分析顯示自噬相關基因Beclin1的表達是影響HSCC患者預后的獨立危險因素。 實驗結論： 自噬相關基因Beclin1和LC3在HSCC中表達顯著降低,這種異常表達與HSCC腫瘤的臨床分期、分化程度以及頸部淋巴結轉移等臨床病理特征有關。Beclin1陰性表達和LC3低表達與患者預后不良相關,此外,Beclin1是影響HSCC患者總體生存率的獨立預后因素,這些結果提示自噬相關基因可能成為治療HSCC的新靶向分子。 第二部分敲掉Becl in1對下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞系凋亡及增殖的影響 研究目的： 將Beclin1-siRNA轉導入人下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞系中,從而研究敲掉Beclin1對FaDu細胞系凋亡、增殖和轉移侵襲能力的影響。實驗方法： 1.采用脂質體法(lipofectamine2000)將Beclin1-siRNA轉染到人下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞系中,通過Real-time PCR和Western blot方法檢測Beclin1-siRNA的轉染效率。采用Western blot方法檢測LC3-II蛋白水平在各實驗組細胞中的表達情況。 2.應用Annexin V-APC單染法流式細胞儀檢測敲掉Beclin1對FaDu細胞凋亡的影響。 3.利用MTT方法檢測Beclin1-siRNA轉染FaDu細胞后,造成Beclin1低表達對細胞增殖活性的影響。 4.采用Transwell侵襲實驗檢測Beclin1-siRNA對FaDu細胞系轉移侵襲能力的影響。 實驗結果： 1.脂質體法(lipofectamine2000)將Beclin1-siRNA轉染入人下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞系后,瞬時轉染效率可達70%。 Real-time PCR和Western blot方法結果顯示與陰性對照組相比,Beclin1-siRNA轉染組細胞中Beclin1表達顯著降低(P0.05),即Beclin1-siRNA可以引起B(yǎng)eclin1在FaDu細胞中的表達下調。我們通過Western blot方法進一步檢測LC3-Ⅱ在各實驗組細胞中的表達情況,結果顯示與陰性對照組相比,Beclin1-siRNA轉染組FaDu細胞中LC3-Ⅱ的表達明顯降低(P0.003)。 2. Annexin V-APC單染法檢測細胞凋亡,結果顯示Beclin1-siRNA轉染組和陰性對照組細胞凋亡率分別是17.11±0.46%和4.773±0.3%,通過統(tǒng)計學分析,與陰性對照組相比,FaDu細胞系經(jīng)Beclin1-siRNA轉染后細胞凋亡數(shù)顯著增加(P=0.001)。 3.MTT方法結果表明與空白對照組和陰性對照組相比較,敲掉Beclin1后在96h內(nèi)FaDu細胞增殖未見明顯差異(P0.05),即Beclin1低表達對FaDu細胞增殖活性的影響無統(tǒng)計學意義。 4. Transwell實驗結果顯示空白對照組、陰性對照組和Beclin1-siRNA轉染組中進入小室的FaDu細胞轉移率分別是1.844±0.035、1.918±0.029和3.306±0.362,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.02),即與對照組相比,Beclin1-siRNA轉染組細胞的轉移侵襲能力明顯增強。 實驗結論： 通過Beclin1-siRNA轉染人下咽鱗狀細胞癌FaDu細胞系從而敲掉Beclin1,可抑制細胞自噬。與對照組相比,Beclin1(?)低表達可誘導FaDu細胞凋亡,并增強其轉移侵襲能力,但對細胞增殖活性無明顯影響。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.63

【參考文獻】

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1 Fanny Daniel;Agnès Legrand;Dominique Pessayre;Nathalie Vadrot;Véronique Descatoire;Dominique Bernuau;;Partial Beclin 1 silencing aggravates doxorubicin-and Fasinduced apoptosis in HepG2 cells[J];World Journal of Gastroenterology;2006年18期

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本文編號：1595261