本文選題：ABCG2　切入點(diǎn)：鼻咽癌　出處：《華中科技大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的：探討ABCG2在鼻咽癌活檢標(biāo)本及鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2中的表達(dá)及其與鼻咽癌化療中的多藥耐藥性的關(guān)系。 材料和方法：鼻咽癌活檢標(biāo)本取自30位鼻咽癌患者,對(duì)照組粘膜是20份鼻咽炎性組織,取自20位慢性鼻咽炎患者的鼻咽部活檢組織。采用實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)ABCG2 mRNA的表達(dá),用免疫組化的方法檢測(cè)ABCG2蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：鼻咽癌活檢組織中,ABCG2在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均高于鼻咽炎性組織中的表達(dá)(t=5.4060,P=0.0124),而且在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中,其表達(dá)顯著增高(t=5.4547,P=0.014)。我們用低濃度的托泊替康(0.75μg/ml)和鹽酸米托蒽醌(0.6μg/ml)分別處理CNE-2細(xì)胞24小時(shí),48小時(shí)和72小時(shí)。Real-time PCR的結(jié)果表明在托泊替康或者鹽酸米托蒽醌處理之后,ABCG2 mRNA表達(dá)增高,并與處理時(shí)間正相關(guān)(r=0.9857,P=0.0143)。 結(jié)論：ABCG2在鼻咽癌中相對(duì)高表達(dá),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),很可能是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個(gè)分子標(biāo)志,而且ABCG2可能參與了鼻咽癌化療中的多藥耐藥。 目的：探討ABCG2在Mitoxantrone處理CNE-2細(xì)胞過程中的作用 方法：用不同濃度Mitoxantrone (0,10 nM,20 nM,40 nM,60 nM,80 nM)處理CNE-2細(xì)胞24h,48h和72h后,用MTT法分析加入ABCG2特異性抑制劑FTC前后其IC50的變化,并用Realtime-PCR和Western Blot檢測(cè)Mitoxantrone處理前后ABCG2mRNA和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：在5μM FTC存在時(shí),CNE-2細(xì)胞24h,48h和72h的IC50都減少約30%。說明當(dāng)ABCG2的作用被抑制后,CNE-2細(xì)胞對(duì)Mitoxantrone更敏感。通過用Realtime-PCR發(fā)現(xiàn)Mitoxantrone可以誘導(dǎo)ABCG2 m RNA的表達(dá),并且有藥物濃度依賴性,在24h,48h和72h的相關(guān)系數(shù)分別是r2=0.9520,P=0.0009；r2=0.8826,P=0.0054 and r2=0.9351,p=0.0016,也與作用的時(shí)間正相關(guān),Mitoxantrone10nM,20 nM,40 nM,60 nM,80 nM時(shí),相關(guān)系數(shù)分別是r2=0.9505,P=0.0251；r2=0.9650,P=0.0177；r2=0.9923,P=0.0039；r2=0.9671,P=0.0166;r2=0.9672,P=0.0155。WB檢測(cè)蛋白的表達(dá)與Real-time PCR的結(jié)果相一致。 結(jié)論：用Mitoxantrone處理CNE-2細(xì)胞時(shí),細(xì)胞膜上表達(dá)的ABCG2可能將細(xì)胞內(nèi)的Mitoxantrone轉(zhuǎn)運(yùn)出去以保護(hù)細(xì)胞,這也可能是ABCG2參與多藥耐藥性的機(jī)制。 目的：構(gòu)建靶向人ABCG2基因的pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表達(dá)質(zhì)粒,運(yùn)用RNA干擾下調(diào)ABCG2基因在鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2中的表達(dá),并篩選出其基因沉默效果最明顯的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體。 方法：針對(duì)ABCG2基因的mRNA序列設(shè)計(jì),分別構(gòu)建3個(gè)shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體和1個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)粒表達(dá)載體,經(jīng)大腸桿菌擴(kuò)增,酶切、PCR、測(cè)序鑒定,用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-2細(xì)胞,用real-time PCR和western blot檢測(cè)ABCG2基因在mRNA和蛋白水平檢測(cè)抑制效果。 結(jié)果：經(jīng)測(cè)序證實(shí),成功構(gòu)建pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CNE-2細(xì)胞后,ABCG2基因的mRNA水平及蛋白水平明顯下調(diào),其中以1號(hào)重組質(zhì)粒效應(yīng)最強(qiáng),mRNA水平下調(diào)75%,蛋白水平下調(diào)68%。 結(jié)論：成功構(gòu)建以人ABCG2為靶向的pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2的重組質(zhì)粒。其對(duì)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞中ABCG2的表達(dá)具有顯著抑制效應(yīng),為進(jìn)一步研究ABCG2在CNE-2細(xì)胞中的功能和鼻咽癌的基因治療奠定了基礎(chǔ). 目的：觀察沉默ABCG2基因的表達(dá)后,CNE-2細(xì)胞對(duì)Mitoxantrone敏感性的變化,探討ABCG2在鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2耐藥中的作用機(jī)制。 方法：建立轉(zhuǎn)染pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染control質(zhì)粒的穩(wěn)定單克隆細(xì)胞,用不同濃度的Mitoxantrone (0,10 nM,20 nM,40 nM,60nM,80 nM)處理CNE-2, CNE-2/siRNA-ABCG2和CNE-2/control細(xì)胞24h,48h和72h,用MTT實(shí)驗(yàn)分析三個(gè)時(shí)間點(diǎn),每種細(xì)胞的IC50；并用35.3 nMMitoxantrone(24h時(shí)CNE-2細(xì)胞IC50的濃度)處理CNE-2, CNE-2/siRNA-ABCG2和CNE-2/control細(xì)胞24h,用CCK-8和流式細(xì)胞檢測(cè)分析各種細(xì)胞的增殖情況和細(xì)胞周期的變化。 結(jié)果：在24h,48h和72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),CNE-2/siRNA-ABCG2細(xì)胞的IC50s均比CNE-2細(xì)胞要低(t=11.9137,P=0.0003)；用35.3 nM Mitoxantrone (24h時(shí)CNE-2細(xì)胞IC50的濃度)作用CNE-2, CNE-2/siRNA-ABCG2和CNE-2/control細(xì)胞,每天用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞生長情況,連續(xù)檢測(cè)十天,繪制生長曲線,發(fā)現(xiàn)CNE-2／siRNA-ABCG2細(xì)胞的增殖與CNE-2細(xì)胞相比,明顯減慢(t=2.2614,P=0.036)；35.3nM Mitoxantrone處理之后,CNE-2細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的比例從8.70%增加到20.91%,G1期細(xì)胞的比例從37.22%增加到40.43%,G2／M期細(xì)胞比例從33.76%下降到17.54%, CNE-2/siRNA-ABCG2細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的比例由8.32%增加到29.73%,G1期細(xì)胞的比例由39.94%增加到41.15%,G2／M期細(xì)胞比例由30.47%下降到6.7%。 結(jié)論：轉(zhuǎn)染pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核質(zhì)粒的CNE-2/siRNA-ABCG2細(xì)胞對(duì)Mitoxantrone的敏感性增加。 目的：探討ABCG2在Mitoxantrone處理鼻咽癌裸鼠移植瘤過程中的作用 方法：建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,用10nM Mitoxantrone分別在CNE-2,CNE-2／siRNA-ABCG2以及CNE-2/control細(xì)胞形成的移植瘤的體部和基底部多點(diǎn)微量注射,注射等體積的PBS作為對(duì)照組,記錄腫瘤體積的增長曲線,并在4周后處死裸鼠,取出移植瘤,用TUNEL檢測(cè)腫瘤的細(xì)胞原位凋亡率。 結(jié)果：60只裸鼠無一死亡,體重均勻增加,成瘤率100%。在CNE-2組,CNE-2／siRNA-ABCG2組和CNE-2/control組中,注射Mitoxantrone組的腫瘤體積的增長均比相應(yīng)的注射PBS組要慢；CNE-2組和CNE-2/control組之間,注射Mitoxantrone組和注射PBS組的腫瘤體積的增長均無明顯差異(t=0.9678,P=0.3460);在CNE-2組,CNE-2/siRNA-ABCG2組和CNE-2/control組中,三組注射PBS的裸鼠腫瘤體積增長均無明顯差異(P0.05)；在CNE-2組和CNE-2/siRNA-ABCG2組中,用Mitoxantrone處理后,CNE-2/siRNA-ABCG2組腫瘤體積增長明顯比CNE-2組要慢(t=2.6255,P=0.0172)。對(duì)取出的移植瘤進(jìn)行原位TUNEL檢測(cè),發(fā)現(xiàn)各組的凋亡率各不相同。在CNE-2/siRNA-ABCG2組,凋亡率為29.45±5.29%,在CNE-2組,凋亡率為18.51±4.33%,而在CNE-2/control組的凋亡率為12.13±6.04%。在CNE-2組,CNE-2/siRNA-ABCG2組和CNE-2/control組三組中,用PBS處理的腫瘤凋亡無明顯差異。 結(jié)論：抑制了ABCG2基因的表達(dá)后,CNE-2移植瘤對(duì)Mitoxantrone的敏感性增強(qiáng),ABCG2的表達(dá)是鼻咽癌耐藥的重要原因。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R739.63

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1590187