本文選題：鼻咽癌　切入點：BCAT1基因　出處：《中南大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我國南方和東南亞各國發(fā)病率高、危害大的惡性腫瘤之一,具有明顯的種族性和地域性,95%以上屬于低分化癌和未分化癌類型,容易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移(轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致鼻咽癌患者死亡的主要原因),目前主要以放射治療為主。雖然放療設(shè)備及技術(shù)在不斷進步,但鼻咽癌的五年生存率仍然維持在50%-60%左右,并未從根本上改善。因此探索其病因及尋找新的有效治療方法尤為重要。 流行病學(xué)及病因?qū)W研究表明遺傳因素(遺傳易感性)、EB病毒感染和其它環(huán)境因素(主要是化學(xué)致癌物等)均與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。在這些因素的共同作用下,正常鼻咽上皮細(xì)胞發(fā)生遺傳變異事件和表遺傳學(xué)改變的不斷積累,導(dǎo)致瘤基因的激活和抑瘤基因的失活,最終引起細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。目前研究表明,鼻咽癌顯著的種族易感性和家族聚集現(xiàn)象表明遺傳基因的改變在鼻咽癌中起十分重要的作用,但與其他人類常見的惡性腫瘤相比,鼻咽癌發(fā)病的分子基礎(chǔ)和相關(guān)的分子遺傳學(xué)改變所知并不多,鼻咽癌發(fā)病的具體分子機制仍未闡明,因此尋找、鑒定與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的基因、研究其功能,是揭開鼻咽癌發(fā)病分子機制的必然途徑,具有十分重要的意義。既往研究發(fā)現(xiàn),一些原瘤基因(例如HRAS, cyclin D1、MDM2、STAT3、EGFR)和抑瘤基因(例如P53、P16P53、RASSF1A、DLC-1、LTF、BLU等)在鼻咽癌中異常表達(dá),但尚未證實為鼻咽癌特異性瘤基因或抑瘤基因。因此需要我們從新的角度去重新認(rèn)識和獲得鼻咽癌關(guān)鍵的瘤基因和抑瘤基因信息。 我室尹志華和黃仲曦等利用香港、臺灣、湖南和廣東五個實驗室發(fā)表的170例鼻咽癌比較基因組雜交數(shù)據(jù),構(gòu)建了鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的樹模型,以此來探討鼻咽癌的發(fā)病機制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),鼻咽癌相關(guān)的重要染色體變異事件共11個,包括2個鼻咽癌發(fā)病的早期事件-3p26-13和+12p12,其中+12p12事件為首次報道。LOH及染色單體轉(zhuǎn)移實驗提示3p的丟失為鼻咽癌的早期事件以及在此區(qū)域存在鼻咽癌相關(guān)抑瘤基因。最近的研究進一步表明：3p21.3區(qū)域存在多個候選抑瘤基因(如RASSF1A1、BLU和LTF),其基因啟動子區(qū)在鼻咽癌組織中常常存在高度甲基化導(dǎo)致其表達(dá)明顯下調(diào)。這些證據(jù)均顯示了樹模型預(yù)測的準(zhǔn)確性。因此,樹模型首次發(fā)現(xiàn)的以擴增為主的+12p12-11為鼻咽癌的早期事件,為尋找鼻咽癌關(guān)鍵瘤基因提供了新的切入點。 [12p12-11擴增基因的篩選] 染色體擴增常導(dǎo)致瘤基因拷貝數(shù)增加和過表達(dá),通過檢測腫瘤組織中染色體擴增區(qū)域內(nèi)候選瘤基因的過表達(dá)已經(jīng)成為尋找特定腫瘤相關(guān)瘤基因的重要途徑。染色體12p12-11長度為19Mb,包含123個已知基因和表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag, EST)。已有研究表明,+12p是大腸癌的早期事件,可能是生殖細(xì)胞腫瘤的晚期事件以及卵巢癌的中晚期事件。利用MEDLINE文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫及本實驗室已完成的鼻咽癌cDNA微陣列數(shù)據(jù)資料,我們從12p12-11區(qū)初步確定了18個鼻咽癌相關(guān)候選瘤基因(DDX11、LDHB、CASC1、KRAS2、BCAT1、PTHLH、SOX5、PDE3A、CMAS、BHLHB3F、KCNJ8、PKP2、EKI1、PTX1、DNM1L、SSPN、RECQL、SLCO1A2),其中已明確的瘤基因及候選瘤基因有6個(DDX1、LDHB、CASC1、KRAS2、BCAT1、PTHLH),另外12個基因與細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖相關(guān)。采用RT-PCR和定量RY-PCR方法檢測鼻咽癌和慢性鼻咽炎組織中這18個基因的表達(dá)水平,結(jié)果顯示：其中9個基因(RECQL、PDE3A、SLCOo1A2、ASC1、DDX1、SSPN、PTHLH、BHLHB與PKP2)在慢性鼻咽炎與鼻咽癌組織中均無表達(dá)；5個基因(CMAS1、DNM1L、ETNK1、LDHB與SOy)表達(dá)水平在36例鼻咽癌及8例慢性鼻咽炎組織之間無顯著差異(P0.05)；而有4個基因(BACT1、KCNJ8、PTX1與KRAS2)在鼻咽癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)(P0.05),提示其可能與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。其中KCNJ8為ATP-敏感鉀離子通道基因的一個亞類,與細(xì)胞的分泌和肌肉收縮有關(guān),而與腫瘤發(fā)生及細(xì)胞的生長、增殖相關(guān)報道較少；PTX1主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體之間物質(zhì)的膜運輸,僅發(fā)現(xiàn)其在前列腺癌中表達(dá)下調(diào)；KRAS2在鼻咽癌中的研究頗多,其表達(dá)明顯高于慢性鼻咽炎；而BCAT1(branched chain aminotransferase 1)基因編碼支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶,在Burkitt's淋巴瘤、乳腺癌組織中明顯上調(diào),與細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān),在鼻咽癌中尚未有相關(guān)報道。因此我們將其作為進一步研究的對象,探討B(tài)XAT1與鼻咽癌的關(guān)系。 [BCAT1基因在鼻咽癌不同病理階段中的表達(dá)] 從12p12-11篩選出的相關(guān)瘤基因回到癌前病變各階段去考察能認(rèn)識這些基因在鼻咽癌發(fā)病過程中的真正地位和意義,因此我們采用了免疫組化分析BCAT1蛋白在鼻咽正常上皮、增生活躍、輕中度、重度增生和鼻咽癌組織中的表達(dá)。結(jié)果表明,在正常假復(fù)層纖毛柱狀上皮、復(fù)層鱗狀上皮、輕中度增生、重度增生和鼻咽癌組織中均能檢測到BCAT1蛋白不同程度的陽性表達(dá),陽性信號定位于細(xì)胞胞漿中；BCAT1蛋白在正常上皮、輕中度增生、重度增生和鼻咽癌組織中陽性表達(dá)率分別為23.6%(17／72)、75%(18／24)、88.9%(8／9)和88.75(71／80)；結(jié)果提示在鼻咽部出現(xiàn)輕度增生早期病理改變時,BCAT1的表達(dá)就明顯增高(P0.05),這說明BCAT1基因?qū)τ诒茄拾┑陌l(fā)生可能起重要作用,這也為進一步分析該基因表達(dá)異常的分子機制提供了依據(jù)。 [探討B(tài)CAT1基因在鼻咽癌中異常表達(dá)的可能機制] 探討瘤基因表達(dá)上調(diào)的機制主要從遺傳學(xué)改變和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控兩方面進行。首先,通過PCR結(jié)合測序的方法分析20例鼻咽癌中BCAT1的11個外顯子突變情況,共檢測出1個外顯子區(qū)SNP位點,提示基因突變對BCAT的表達(dá)無明顯影響。其次,拷貝數(shù)增加被認(rèn)為是瘤基因異常激活的一個重要機制,分析基因內(nèi)部及其附近微衛(wèi)星位點的擴增可以間接反映基因組中基因的擴增情況。采用Real-timePCR分析了BCAT1基因內(nèi)部D12S1435、D12S1617和RH44650三個微衛(wèi)星位點在鼻咽癌組織中擴增情況。結(jié)果表明,有42.4%(12／28)鼻咽癌組織中存在BCAT1基因微衛(wèi)星位點的擴增。提示基因拷貝數(shù)的擴增可能對BCAT1在鼻咽癌組織中表達(dá)上調(diào)起一定作用。 真核基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是一個非常復(fù)雜的過程,而轉(zhuǎn)錄因子參與的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用。生物信息學(xué)分析顯示在BCAT15’端非翻譯區(qū)-155／-200bp區(qū)域包含有c-Myc結(jié)合位點。為了揭示c-Myc是否對BCATl的表達(dá)具有直接調(diào)控作用,我們進行了染色質(zhì)免疫沉淀實驗(ChIP)。結(jié)果證實,c-Myc轉(zhuǎn)錄因子可以直接結(jié)合于BCAT1基因啟動子區(qū)的c-Myc結(jié)合位點。RT-PCR與免疫組化表明鼻咽癌中BCAT1和c-Myc的mRNA和蛋白的表達(dá)均上調(diào),進一步利用RNA干擾技術(shù)建立了穩(wěn)定干擾c-Myc表達(dá)的5-8F鼻咽癌細(xì)胞系(命名為5-8F/Si-c-myc),結(jié)果發(fā)現(xiàn),封閉內(nèi)源性c-Myc的表達(dá)可以下調(diào)BCAT1基因mRNA的表達(dá)水平。另外,我們將帶有包含c-Myc結(jié)合位點的BCATl調(diào)控序列與熒光素酶報告基因連接構(gòu)建重組報告基因載體,分別轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空白載體的5-8F細(xì)胞(即5-8F/si-control)以及5-8F/si-c-myc細(xì)胞中,經(jīng)報告基因活性分析發(fā)現(xiàn),封閉內(nèi)源性c-Myc表達(dá)后,與對照組相比,重組報告基因的熒光素酶活性降低。而在轉(zhuǎn)染c-Myc基因的COS7細(xì)胞系中具有較強的熒光素酶活性。上述實驗結(jié)果說明c-Myc對BCAT1基因的表達(dá)具有直接的正調(diào)控作用。 [利用RNA干擾技術(shù)研究BCAT1基因在5-8F細(xì)胞的作用] 采用pSUPER.retro逆病毒載體系統(tǒng),構(gòu)建了針對BCAT1的RNAi載體(shBCAT1)。經(jīng)測序結(jié)果證實后,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將shBCAT1導(dǎo)入5-8F細(xì)胞,嘌呤霉素篩選獲得抗性克隆,PCR證實抗性克隆中含有shBCAT1; RT-PCR結(jié)果表明,shBCAT1表達(dá)載體能特異性導(dǎo)致BCAT1 mRNA的表達(dá)下調(diào)了90%；Western Blotting分析表明細(xì)胞中的BCAT1蛋白表達(dá)下調(diào)了55%左右,這些說明我們已成功地建立了穩(wěn)定干擾BCAT1基因的5-8F細(xì)胞系。 隨后,我們進一步考察了BCAT1被干擾后對5-8F細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染了shBCAT1的5-8F細(xì)胞(5-8F-shBCATl)阻滯于G1期,G1期細(xì)胞比例增加～16.66%(16.66+2.92,P=0.005),G2期細(xì)胞則減少了～6.91%(6.91+0.76.P=0.001),而對照組5-8F細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的5-8F細(xì)胞(5-8F-blank vector)之間的細(xì)胞周期分布沒有明顯差異。MTT法檢測發(fā)現(xiàn),5-8F-shBCAT1細(xì)胞增殖速度明顯低于對照組5-8F細(xì)胞與5-8F-blank vector細(xì)胞,統(tǒng)計學(xué)分析差異有顯著性(P=-0.00)。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示5-8F-shBCAT1細(xì)胞的克隆形成率明顯低于轉(zhuǎn)染載體組(7.2%vs 38.9%)。另外,遷移實驗和侵襲實驗證實,5-8F-shBCAT1細(xì)胞運動能力和侵襲能力明顯降低。 IBCAT1與LARS2在鼻咽癌中的相互作用及LARS2在鼻咽癌中下調(diào)機制的研究] 生物信息學(xué)是后基因組時代的利器。STRING (http://string80. embl.de/)是目前已知的、揭示已知和預(yù)測蛋白-蛋白之間相互作用的、較廣泛使用的數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫揭示的蛋白-蛋白相互作用既包括直接相互作用(結(jié)合)也包括間接關(guān)聯(lián)作用(功能相關(guān)),其率數(shù)據(jù)來源于基因組背景分析、高通量實驗、共表達(dá)實驗和已公布的數(shù)據(jù)庫(如PUBMED, MIPS)。同時,利用STRING還可以比較不同物種間的數(shù)據(jù)。最新版STRING 8.1收錄了630個物種、超過2,590,259種蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)。 在STRING的界面,輸入BCAT1,可以找到直接和間接相關(guān)蛋白分子10個,它們分別是LRMP、hCG 26005、ENSP00000372、BCKDHA、BCKDHB、IARS2、IARS、LARS2、LARS和BCAT1。從這些基因的染色體定位數(shù)據(jù)中,我們發(fā)現(xiàn)LARS2基因位于鼻咽癌患者高頻丟失區(qū)3p21。 LARS2 (leucyl aminoacyl-tRNA synthetase 2, LARS2)基因編碼亮氨酰-tRNA合成酶。為了探討LARS2基因在鼻咽癌中的可能作用,我們首先采用了RT-PCR、Real-time PCR方法檢測LARS2在8例慢性鼻咽炎組織、36例鼻咽癌組織中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),LARS2在78%(28／36)鼻咽癌組織中存在表達(dá)下調(diào)或缺失,提示LARS2可能是鼻咽癌相關(guān)候選抑瘤基因。接著,我們從遺傳學(xué)(genetic)和表觀遺傳學(xué)(epigenetic)改變兩方面探討了LARS2基因失活的主要機制。1.通過PCR-SSCP并結(jié)合測序方法分析了25例鼻咽癌中啟動子區(qū)和外顯子1突變情況,結(jié)果未檢測出突變和SNP,提示基因突變對于LARS2表達(dá)失活無明顯影響。2.由于基因內(nèi)部及其附近微衛(wèi)星位點的丟失可以間接反映基因組中基因的缺失情況,我們采用了PCR-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染方法分析LARS2基因內(nèi)部的RH25266和SHGC-12886二個微衛(wèi)星位點在鼻咽癌組織中的丟失情況。結(jié)果表明,至少有28%(7／25)的鼻咽癌組織中存在LARS2基因微衛(wèi)星位點的丟失,提示微衛(wèi)星位點的LOH可能對LARS2在鼻咽癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)起一定的作用。3.鑒于啟動子區(qū)DNA異常甲基化是抑瘤基因在表觀遺傳學(xué)改變最為常見的方式,我們首先通過生物信息學(xué)軟件對LARS2啟動子區(qū)CpG島分布情況進行了分析,發(fā)現(xiàn)LARS2啟動子區(qū)存在一個227bp長的CpG島。以此區(qū)域為模板,選擇針對該區(qū)段的甲基化和非甲基化特異性引物,利用甲基化特異性PCR (methylation-specific PCR, MSPCR)技術(shù),我們分析了慢性鼻咽炎和鼻咽癌組織中LARS2啟動子甲基化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),64%(16／25)鼻咽癌組織和12.5%(1／8)慢性鼻咽炎組織存在LARS2基因啟動子甲基化情況,但鼻咽癌組織中LARS2基因甲基化比率明顯高于慢性鼻咽炎組織,兩者存在明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.017),這提示啟動子甲基化是導(dǎo)致LARS2基因表達(dá)下調(diào)的主要因素。 進一步比較發(fā)現(xiàn),BCAT1蛋白和LARS2蛋白的相關(guān)性表現(xiàn)在這兩個蛋白作用于同一條細(xì)胞代謝通路,即亮氨酸代謝。BCAT1在鼻咽癌中顯著上調(diào),而LARS2在鼻咽癌中表達(dá)下調(diào),共同導(dǎo)致了中間產(chǎn)物L(fēng)-亮氨酸的累積。作為一種支鏈氨基酸,L-亮氨酸通過改變mTOR (mammalian target of rapamycin)-raptor復(fù)合體的穩(wěn)定性,激活：mTOR的信號傳導(dǎo)通路。有研究表明,鼻咽癌組織常常存在mTOR的高表達(dá)。一方面,高表達(dá)的mTOR可以通過下游分子S6K1和4E-BP1調(diào)控編碼細(xì)胞周期G1期和S期必需蛋白,如細(xì)胞周期素D1、Rb蛋白、低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)、c-Myc和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、LIP-170等的mRNA翻譯,最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性失控性增殖。另一方面,高表達(dá)的mTOR也可以通過誘導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Id2的表達(dá)影響上皮細(xì)胞的分化�；谝陨蠈嶒灪头治�,我們認(rèn)為BCAT1的表達(dá)增加和LARS2基因的表達(dá)下調(diào)兩者之間存在間接的相互作用關(guān)系,它們共同參與推動鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展。 綜上所述,通過本研究,我們首次從鼻咽癌發(fā)生早期事件+12p12-11區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)鼻咽癌相關(guān)瘤基因BCAT1,并系統(tǒng)、全面地考察了BCAT1蛋白在慢性鼻咽炎、鼻咽癌及鼻咽癌變不同階段組織中的表達(dá)情況,探討了導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)的可能機制,并進一步研究了BCAT1基因在鼻咽癌細(xì)胞中的功能。結(jié)果提示,BCAT1在慢性鼻咽上皮組織和正常鼻咽上皮中正常表達(dá),而在鼻咽癌組織和鼻咽癌變不同階段明顯表達(dá)上調(diào),而這種表達(dá)上調(diào)主要是由于基因擴增所致,而瘤基因c-Myc對其直接調(diào)控也發(fā)揮了一定作用。RNA干擾實驗表明,干擾BCAT1的表達(dá)能夠抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖,導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯。此外,我們通過生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)了與BCAT1蛋白有間接相互作用的LARS2蛋白。LARS2基因在鼻咽癌組織中表達(dá)明顯下調(diào),其失活機制主要是基因啟動子區(qū)甲基化。鼻咽癌中BCAT1顯著上調(diào)和LARS2表達(dá)下調(diào),共同導(dǎo)致了中間產(chǎn)物L(fēng)-亮氨酸的累積,而L-亮氨酸則可以通過激活mTOR的信號傳導(dǎo)通路最終導(dǎo)致細(xì)胞的惡性失控性增殖。當(dāng)然,生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果還有待實驗進一步驗證。
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【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1588908