本文選題：鼻咽癌　切入點：棉酚衍生物　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景： 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一類來源于鼻咽粘膜的惡性腫瘤,具有明顯的種族和地理分布[1,2]。中國南部和東南亞地區(qū)鼻咽癌每年發(fā)病率約為20/100,000,然而,在世界其他地方發(fā)病率僅為1/100,000。每年約有80,000新發(fā)病例被診斷為鼻咽癌,且其中50,000死于此疾病[3]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的粗略統(tǒng)計,80%左右的鼻咽癌發(fā)生在我國,且近年來發(fā)病率有逐年升高的趨勢。其病因及發(fā)病機理尚不完全清楚,普遍認為鼻咽癌的發(fā)生是遺傳易感性、EB病毒(Epstein-Barr Virus EBV)的感染以及環(huán)境因素之間相互作用的結(jié)果。 目前,放射治療聯(lián)合化療是早期及局部晚期鼻咽癌治療的標(biāo)準(zhǔn)模式,但放化聯(lián)合治療后局部復(fù)發(fā)率仍高達50%左右,5年總生存率僅為34%-53%[5],轉(zhuǎn)移性鼻咽癌的預(yù)后更差[4]。目前研究已經(jīng)表明鼻咽癌治療失敗的重要原因之一是對放化療耐受。已經(jīng)清楚大部分化療藥物是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡發(fā)揮作用的,因此細胞凋亡的阻滯與腫瘤對化療的耐藥性有密切關(guān)系。 在鼻咽癌中高表達多種癌基因,如抗凋亡的Bcl-2家族成員、LMP1和c-Myc等[6],Bcl-2被認為是一種廣義的抗凋亡基因,編碼相對分子量為25×1000u的癌蛋白,Bcl-2蛋白是細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族中的重要抗凋亡蛋白,與腫瘤的耐藥和復(fù)發(fā)有關(guān),其通過抑制腫瘤細胞凋亡或自體吞噬,進而引起腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。 Lu等用FISH和免疫組化方法檢測到在80%鼻咽癌標(biāo)本中Bcl-2呈高表達[7]。另有多數(shù)研究表明其高表達能阻礙腫瘤細胞的凋亡,并可能和鼻咽癌的發(fā)生、演進及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。1990年Reed等首次報道應(yīng)用反義bcl-2基因治療抑制白血病細胞生長,以后國內(nèi)外在體外和動物實驗的不斷深入,認為反義bcl-2基因治療還能增強白血病細胞對化療藥物的敏感性。Bcl-2可成為鼻咽癌治療的靶向目標(biāo)。傳統(tǒng)治療的長期療效欠佳,反義bcl-2基因治療雖可能開辟鼻咽癌治療的新前景,但基因治療目前還面臨許多困難。隨著人們對Bcl-2家族蛋白與腫瘤關(guān)系研究的深入,針對各作用機制的抗腫瘤藥物也被相繼開發(fā),基于Bcl-2的腫瘤生物治療手段和優(yōu)勢肽段、有機小分子等新藥已經(jīng)用于某些合適的抗凋亡蛋白。有機小分子及其衍生物是Bcl-2抑制劑開發(fā)的重要方向。 棉酚(gossypol),系存在于錦葵科棉屬植物棉花的種子、莖、葉及根部等器官中的一種含量較高的黃色多元酚類化合物,是一種Bcl-2的小分子阻斷劑。研究發(fā)現(xiàn),棉酚的活性成分左旋棉酚主要作用于Bcl-2/Bcl-XL基因,阻止其與促凋亡基因如Bak, Bax, Bad等結(jié)合形成異源二聚體,從而誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡。而且在體內(nèi)和體外實驗中均表現(xiàn)出有效的抗腫瘤活性,但左旋棉酚分子結(jié)構(gòu)兩端的醛基,被認為與毒性相關(guān),雖然作用較弱,但很大程度上限制了人體對左旋棉酚的最大耐受量,另外這種混合物進入人體內(nèi)容易與其他蛋白結(jié)合,減弱藥物的治療效果,增加毒性作用。去除兩個醛基后合成的Apogossyplone (ApoG2)是棉酚的一種新型衍生物,對其進行細胞毒性測試,結(jié)果表明對腫瘤細胞生長的抑制作用較左旋棉酚強更,具有抗腫瘤活性高、毒性小、穩(wěn)定性好的特點,顯示出更好的發(fā)展前景。 紫杉醇是提取自太平洋紫杉樹樹皮的典型的紫杉烷類化療藥物,能抑制細胞有絲分裂中紡錘體的形成,使細胞阻滯于G2/M期,導(dǎo)致細胞凋亡。紫杉醇類與順鉑和5-氟尿嘧啶聯(lián)合應(yīng)用對頭頸部腫瘤有更好的的治療效果,這一策略也用于鼻咽癌[8]。近年來,化療在鼻咽癌治療中的地位越來越重要,特別是對局部晚期鼻咽癌,同期放化療較單純放療可顯著近期療效和長期生存,同期化療起著增加放射敏感性以及控制遠處微小轉(zhuǎn)移灶的作用。但化療仍存在著毒副反應(yīng)較大,容易出現(xiàn)耐藥等缺點。 自噬和凋亡是兩種截然不同的程序性細胞死亡方式,是維持細胞自我平衡的重要機制,在生物組織器官分化、生長、發(fā)育、自我更新、疾病發(fā)生、腫瘤形成中均有重要作用。既往認為,化療藥物殺滅腫瘤細胞主要是通過誘導(dǎo)細胞凋亡實現(xiàn)的,而自噬一直被認為是細胞生存的一種機制。近年細胞自噬逐漸成為研究熱點,研究表明,自噬性細胞死亡是某些化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡的另一重要方式。在自噬研究過程中發(fā)現(xiàn)Beclinl和LC3是兩種重要的自噬基因。Beclinl是最早發(fā)現(xiàn)的與自噬相關(guān)的基因,Beclinl基因目前作為一種抑癌基因已經(jīng)基本達成共識。其在40%～75%的人類自發(fā)性乳腺癌、卵巢癌及鼻咽癌存在染色體17q21位點等位基因缺失。 因此,為了提高鼻咽癌病患的生存率和增強病患對放化療的耐受力,抗凋亡蛋白Bcl-2已成為研發(fā)靶向藥物的一個熱點。本實驗研究探討ApoG2聯(lián)合紫杉醇(PTX)作用對人鼻咽癌CNE-2細胞體內(nèi)外的抑制效果,并初步探討其可能機制,為鼻咽癌治療方面提供一些新的研究方向。研究目的： 本實驗以高表達Bcl-2的CNE-2鼻咽癌細胞為研究對象,旨在探討ApoG2聯(lián)合紫杉醇在體內(nèi)外對鼻咽癌CNE-2細胞是否有協(xié)同作用,并進一步探討ApoG2的作用及可能機制,為ApoG2用于鼻咽癌試驗性治療提供理論依據(jù)。 實驗方法： 1.采用MTT體外增殖法研究不同濃度紫杉醇、ApoG2單藥及兩藥聯(lián)合作用于鼻咽癌細胞系CNE-2的體外增殖抑制作用； 2.利用Hoechst33258熒光染色法觀察細胞在ApoG2及紫杉醇作用于鼻咽癌細胞系CNE-2后引起的細胞核形態(tài)的變化； 3.利用吖啶橙(AO)熒光染色法觀察細胞在ApoG2及紫杉醇作用于鼻咽癌細胞系CNE-2后引起的細胞形態(tài)的變化； 4.流式細胞儀分析ApoG2及紫杉醇作用于鼻咽癌細胞系CNE-2后引起的細胞凋亡率及自噬率的變化情況； 5.Western blot法檢測經(jīng)ApoG2處理后的CNE-2細胞Bcl-2蛋白的表達變化； 6.建立裸鼠移植瘤模型,觀察ApoG2、紫杉醇單藥及兩者聯(lián)合對鼻咽癌細胞移植瘤的生長抑制作用； 7.免疫組化檢測各處理組移植瘤組織中Bcl-2及Beclin1蛋白的表達變化。 實驗結(jié)果： 1.通過MTT體外增殖實驗檢測提示ApoG2與紫杉醇單藥對鼻咽癌細胞系CNE-2具有生長增殖抑制作用,細胞的抑制作用隨藥物濃度提高而增強,呈濃度依賴性,并且聯(lián)合用藥組有協(xié)同作用(CDI1)； 2.Hoechst33258熒光染色結(jié)果提示,ApoG2與紫杉醇聯(lián)合作用CNE-2細胞48h與對照組及單獨處理組相比細胞呈現(xiàn)出更明顯核固縮、碎裂,染色質(zhì)凝集、凋亡小體形成等凋亡現(xiàn)象;而對照組細胞則呈現(xiàn)彌散均勻,淡藍色的正常細胞核； 3.AO熒光染色結(jié)果提示,ApoG2與紫杉醇聯(lián)合作用CNE-2細胞48h后,胞漿或胞核染成亮紅色熒光,為酸性自噬泡,與對照組及單獨處理組相比細胞呈現(xiàn)出更明顯自噬現(xiàn)象； 4.流式細胞檢測結(jié)果提示,ApoG2聯(lián)合紫杉醇作用較各單藥組能更明顯誘導(dǎo)CNE-2細胞發(fā)生凋亡,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。APoG2與紫杉醇聯(lián)合作用組自噬熒光強度明顯增強,與ApoG2處理組,紫杉醇處理組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)； 5. Western blot法檢測Bcl-2蛋白表達結(jié)果提示,與空白對照組相比,ApoG2組Bcl-2蛋白表達下調(diào)(P0.05)。 6.體內(nèi)實驗顯示ApoG2組、紫杉醇組、ApoG2+紫杉醇組對CNE-2裸鼠移植瘤生長的抑制率分別是54.22%、72.34%和85.90%,ApoG2聯(lián)合紫杉醇較單一治療組可更明顯抑制腫瘤細胞生長(P0.05)； 7.免疫組化法檢測Bcl-2和Beclin1蛋白在移植瘤中的表達,與空白對照組相比,ApoG2組及紫杉醇組均出現(xiàn)不同程度的Bcl-2減少和Beclinl增加,但ApoG2+紫杉醇組中的此兩種蛋白表達變化較單獨紫杉醇和ApoG2組均更明顯(P均0.01)。 結(jié)論： ApoG2聯(lián)合紫杉醇在體內(nèi)外均能增強對鼻咽癌CNE-2細胞的增殖抑制作用,不僅可以提高細胞的凋亡,而且可以提高細胞的自噬性死亡。其機制可能為下調(diào)Bcl-2蛋白以及誘導(dǎo)了Beclinl蛋白的表達相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R739.63

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本文編號：1558665