本文選題：miR-431　切入點：Eya4　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分基礎(chǔ)研究miR-431靶作用Eya4基因調(diào)控耳蝸功能的研究 目的研究miR-431對耳蝸功能的影響及與耳聾的關(guān)系,以補充闡明遺傳性耳聾的病因。同時探討miR-431調(diào)控耳蝸功能的可能分子機制,為遺傳性耳聾的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。 方法主要采用Real-time PCR和microRNA原位雜交技術(shù)確定miR-431在小鼠耳蝸的時空表達譜。利用已構(gòu)建的miR-431轉(zhuǎn)基因(Transgenic, Tg)小鼠,進行聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試評估小鼠聽力,在動物水平了解miR-431對耳蝸功能的影響。利用小鼠基底膜鋪片和耳蝸切片等技術(shù)探求miR-431轉(zhuǎn)基因小鼠導致聽力下降的耳蝸結(jié)構(gòu)變化。應(yīng)用生物信息學軟件預(yù)測并利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)明確miR-431的靶基因。最后利用PC12細胞和原代培養(yǎng)的新生小鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細胞,在細胞水平進一步驗證miR-431對神經(jīng)元發(fā)育和分化的影響。 結(jié)果miR-431在新生小鼠的耳蝸中的螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti器和血管紋中高表達,表達量隨小鼠發(fā)育而逐漸減少。檢測了A和B兩個系13周齡的miR-431Tg小鼠和同窩的野生型(Wildtype, Wt)小鼠的聽力,miR-431Tg小鼠聽覺反應(yīng)域明顯高于Wt小鼠。miR-431Tg小鼠基底膜毛細胞可見點狀缺失,螺旋神經(jīng)節(jié)細胞分布較wt小鼠稀疏,石蠟切片上測量Rosenthal小管中螺旋神經(jīng)節(jié)細胞密度顯示,miR-431Tg小鼠明顯低于wt小鼠。本研究發(fā)現(xiàn),Eya4是miR-431的一個靶基因,miR-431Tg小鼠耳蝸中EYA4蛋白的含量減少。在PC12細胞中過表達miR-431抑制PC12細胞的分化。同時,miR-431Tg小鼠耳蝸原代螺旋神經(jīng)節(jié)細胞成熟神經(jīng)元數(shù)量和軸突長度降低。 結(jié)論miR-431在小鼠耳蝸中過表達可導致小鼠聽力下降。miR-431的高表達抑制了其靶基因Eya4的翻譯,使EYA4蛋白形成受阻,進而導致螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少,損害了聽覺信號傳導徑路。 第二部分臨床研究雙側(cè)耳道閉鎖患者Baha效果分析 目的評估雙側(cè)先天性耳道閉鎖患者應(yīng)用骨錨式助聽器(Bone-anchored hearing aid. Baha)后的聽力效果及滿意度,并分析術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生情況及預(yù)防和處理方法。 方法對16例行單側(cè)Baha植入術(shù)的雙側(cè)先天性耳道閉鎖患者進行回顧性分析。分別測試患者在聲場中裸耳與應(yīng)用植入式Baha后的平均聽閾,并應(yīng)用普通話言語測聽材料(Mandarin Speech Test Materials, MSTM)測試言語識別率(Speech Discrimination Scores, SDS)及言語識別閾(Speech Reception Threshold, SRT)。以Baha應(yīng)用情況調(diào)查問卷和兒童格拉斯格受益列表(Glasgow children's benefit inventory, GCBI)評估患者應(yīng)用Baha后的生活質(zhì)量提高程度和滿意度�？偨Y(jié)16例患者術(shù)后皮膚并發(fā)癥的發(fā)生情況和處理方法。 結(jié)果患者裸耳平均聽閾為61.6±7.8dB HL,應(yīng)用植入式Baha后平均聽閾為23.8±5.9dB HL。在45dB HL和65dB HL給聲強度下,裸耳SDS分別為6.7±7.4%和56.5±7.4%,應(yīng)用植入式Baha后SDS提高至86.5±4.4%和90.1±3.4%。裸耳平均SRT為60.6±7.5dB HL,應(yīng)用植入式Baha后降至24.7±5.0dB HL。Baha應(yīng)用情況調(diào)查問卷顯示患者應(yīng)用Baha均獲得滿意效果,GCBI平均受益分數(shù)為45.6±14.4分。16例患者中共發(fā)生皮膚并發(fā)癥5例。對1-2級皮膚反應(yīng)者給予局部抗生素處理；3級反應(yīng)者行二次手術(shù)切除增生皮膚及肉芽組織,其中1例患者更換9m橋基。 結(jié)論雙側(cè)先天性耳道閉鎖患者應(yīng)用植入式Baha后聽閾及言語識別能力得到明顯提高,生活質(zhì)量亦獲得顯著改善,患者主觀滿意度較高。橋基周圍皮膚感染、皮膚過度增生是Baha植入術(shù)最常見的并發(fā)癥。
[Abstract]:Part one basic study on the regulation of cochlear function by miR-431 targeting Eya4 gene
Objective to study the effect of miR-431 on cochlear function and its relationship with deafness, so as to further clarify the cause of hereditary deafness, and explore the possible molecular mechanism of miR-431 regulating cochlear function, so as to provide a theoretical basis for the prevention and treatment of hereditary hearing loss.
The method mainly uses Real-time PCR and microRNA in situ hybridization to determine the expression of miR-431 in mouse cochlea. The spectrum of space-time with the constructed miR-431 transgenic mice (Transgenic, Tg), auditory brainstem response (ABR) test and evaluation of mice hearing at the animal level to understand the impact of miR-431 on cochlear function. The cochlear structure changes by mouse basement membrane flatmount and cochlea slicing technology to explore miR-431 transgenic mice leads to hearing loss. Using bioinformatics software predicted target genes using dual luciferase reporter assay system. The use of miR-431 specific PC12 cells and primary cultured neonatal mouse spiral ganglion cells, to further verify the effect of miR-431 on neuronal development and differentiation at the cellular level.
The results of miR-431 in neonatal mouse cochlear spiral ganglion in the high expression of Corti and vascular pattern, the expression decreased gradually with the growth of wild type mice. The detection of A and B two 13 week old miR-431Tg mice and littermates (Wildtype, Wt) mice hearing, miR-431Tg mouse auditory response domain the basement membrane was significantly higher than that of Wt mice.MiR-431Tg mice hair cells punctate lack of spiral ganglion cells in WT mice distribution is sparse, paraffin section on the measurement of Rosenthal in tubular spiral ganglion cell density showed that miR-431Tg mice was significantly lower than that of WT mice. The study found that Eya4 is a target gene of miR-431, reduce the content of EYA4 protein miR-431Tg in mouse cochlea the over expression of miR-431 differentiation. Inhibition of PC12 cells in PC12 cells. At the same time, the number of primary miR-431Tg mouse cochlear spiral ganglion cells and axon length of mature neurons decreased.
Conclusion overexpression of miR-431 in mouse cochlea can lead to decreased hearing loss and high expression of.MiR-431, which inhibits the translation of target gene Eya4 and hinders the formation of EYA4 protein, which leads to a decrease in the number of spiral ganglion cells and a damage to the pathway of auditory signal transduction.
Analysis of the effect of the second part of clinical study on Baha in patients with bilateral aural atresia
Objective to evaluate the hearing effectiveness and satisfaction of patients with bilateral congenital atresia treated with Bone-anchored hearing aid. Baha, and analyze the occurrence and prevention and treatment of postoperative complications.
Methods 16 patients underwent unilateral Baha implantation of bilateral congenital aural atresia were analyzed retrospectively. The patients were tested in the sound field and the application of implantable ear bare average hearing threshold of Baha, and the application of Mandarin speech test materials (Mandarin Speech Test Materials, MSTM) test speech recognition rate (Speech Discrimination Scores, SDS) and the speech recognition threshold (Speech Reception, Threshold, SRT). With the application of Baha questionnaire and child benefit list (Glasgow children's benefit Glasgow inventory, GCBI) were assessed after the application of Baha to improve the quality of life and satisfaction. The incidence and treatment methods of 16 cases of patients with postoperative complications of skin.
Results the patients with naked ear average hearing threshold was 61.6 + 7.8dB HL, the average hearing threshold was 23.8 after application of implantable Baha + 5.9dB HL. 45dB and 65dB HL in HL to the sound intensity, naked ear SDS were 6.7 + 7.4% and 56.5 + 7.4%, application of implanted Baha SDS increased to 86.5 + 4.4% and 90.1 + 3.4%. average naked ear SRT 60.6 + 7.5dB HL, application of implanted Baha questionnaire to 24.7 + 5.0dB HL.Baha application showed that patients with Baha with satisfactory results, the average score was 45.6 + GCBI benefit from 14.4.16 patients had skin complications in 5 cases. Given the Bureau of the Ministry of antibiotic treatment of grade 1-2 skin reactions; two surgery hyperplasia of skin and granulation tissue in 3 stage reaction were performed, including 1 cases of patients with replacement of the 9m bridge.
Conclusion bilateral congenital aural atresia patients after application of implantable Baha hearing threshold and speech recognition ability was improved and the quality of life was significantly improved, patient satisfaction is high. The bridge surrounding skin infection, skin hyperplasia is the most common complication of Baha implantation.

【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R764.43

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