本文關(guān)鍵詞： 先天性小耳畸形 DNA甲基化 CpG島 CpG位點(diǎn) 5氮雜胞苷　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的 篩查先天性小耳畸形患者整個(gè)基因組存在甲基化水平異常的CpG島和CpG位點(diǎn)及其相關(guān)差異基因,進(jìn)一步檢測差異基因的RNA表達(dá)水平,研究差異基因CpG島的甲基化水平和基因表達(dá)的關(guān)系,同時(shí)檢測去甲基化藥物5氮雜胞苷干預(yù)后差異基因RNA表達(dá)水平的改變,進(jìn)而探討基因甲基化水平的異常與先天性小耳畸形發(fā)病之間的關(guān)系,為其發(fā)病機(jī)制提供新的科學(xué)理論。 方法 收集先天性小耳畸形患者的殘耳軟骨組織為研究對象,標(biāo)記為實(shí)驗(yàn)組；非耳畸形患者的正常耳軟骨組織作為正常對照,標(biāo)記為對照組。選用基于甲基化DNA免疫共沉淀技術(shù)的Nimblegen CpG啟動子芯片,對實(shí)驗(yàn)組3例及對照組3例樣本的基因組DNA進(jìn)行全基因組28226個(gè)CpG島掃描,用高解析度芯片掃描儀檢測雜交信號并輸出影像,運(yùn)用GenePix Pro6.0軟件提取數(shù)據(jù)并輸出excel表格。按照其中一組全部高甲基化而另一組全部低甲基化的標(biāo)準(zhǔn)篩選,確定兩組之間存在CpG島甲基化水平差異的基因。選用SpectroCHIP芯片,運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析儀對實(shí)驗(yàn)組47例,對照組31例的差異基因的CpG島進(jìn)行各個(gè)CpG位點(diǎn)的檢測,輸出的信號通過EpiTYPER軟件進(jìn)行分析并輸出數(shù)據(jù)。對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),篩選出存在甲基化水平差異的CpG位點(diǎn)。選取實(shí)驗(yàn)組3例,對照組3例,在體外分離、培養(yǎng)殘耳軟骨細(xì)胞和正常耳軟骨細(xì)胞,光鏡下直接觀察細(xì)胞形態(tài)變化,CCK-8法計(jì)數(shù)細(xì)胞,繪制細(xì)胞生長曲線,進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫組化染色。將對照組第3代細(xì)胞選取部分作為對照2組。對照2組加入不同濃度的5氮雜胞苷干預(yù),通過CCK-8法繪制生長曲線和計(jì)算細(xì)胞活力評估此藥物對細(xì)胞增殖的影響及細(xì)胞毒性檢測。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對實(shí)驗(yàn)組3例組織、1例細(xì)胞及對照組1例組織、1例細(xì)胞進(jìn)行差異基因RNA表達(dá)水平的檢測,同時(shí)檢測對照2組2例細(xì)胞的差異基因RNA表達(dá)水平,對輸出的Ct值應(yīng)用Prizm 4統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行T-test分析,找出實(shí)驗(yàn)組與對照組間RNA表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的差異基因。同時(shí)對比對照組與對照2組間RNA表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的差異基因。 結(jié)果 1.實(shí)驗(yàn)組與對照組在全基因組范圍內(nèi),存在36個(gè)具有甲基化水平差異的CpG島,其中有29個(gè)與已命名的29個(gè)基因相關(guān),初步建立了先天性小耳畸形的甲基化譜。 2.實(shí)驗(yàn)組與對照組在COL18A1、MYH14、RBMY1A1、ZIC3這四個(gè)差異基因的CpG島內(nèi)有6個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平存在差異且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 3.實(shí)驗(yàn)組與對照組的原代及1、2、3代軟骨細(xì)胞在生物學(xué)性狀及相關(guān)特異性上均無明顯差異,細(xì)胞增殖及毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)5氮雜胞苷對正常耳軟骨細(xì)胞的生長具有劑量依賴性的抑制作用。 4.在軟骨組織中,COL18A1基因的RNA表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組較對照組低,具有非常顯著的差異；MYH14、RBMYA1這2個(gè)基因的RNA表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組均較對照組高,且具有顯著性差異；ZIC3基因的RNA表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組較對照組高,但不具有顯著差異。在軟骨細(xì)胞中,COL18A1, MYH14, ZIC3這3個(gè)基因的RNA表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組均較對照組高,但不具有顯著性差異；對照組與對照2組在COL18A1, MYH14、ZIC3這3個(gè)基因的RNA表達(dá)水平在對照2組均較對照組高,且具有顯著性差異。 結(jié)論 先天性小耳畸形殘耳軟骨組織與正常耳軟骨組織在全基因組DNA甲基化水平上有36個(gè)CpG島存在差異,進(jìn)一步對存在CpG島甲基化水平差異的其中4個(gè)差異基因的具體CpG位點(diǎn)進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)4個(gè)差異基因共有6個(gè)CpG位點(diǎn)具有甲基化水平差異,對此4個(gè)差異基因的RNA表達(dá)水平檢測發(fā)現(xiàn)5氮雜胞苷的去甲基化作用能夠促進(jìn)基因的表達(dá),證實(shí)差異基因的表達(dá)水平與DNA甲基化相關(guān)；MYH14、RBMY1A1這2個(gè)差異基因在實(shí)驗(yàn)組和對照組的表達(dá)差異符合CpG島甲基化水平的差異,表明在先天性小耳畸形中MYH14和RBMY1A1的表達(dá)調(diào)控與DNA的甲基化水平密切相關(guān),從而初步推斷出先天性小耳畸形的發(fā)病可能與DNA的甲基化水平有著密切的關(guān)系。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R440;R764.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1552912