發(fā)布時間：2018-02-28 19:40

  本文關鍵詞： 鼻咽癌 SPLUNC1 TLR4 NF-κB 炎癥　出處：《中南大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目前認為慢性炎癥是20-25%的惡性腫瘤發(fā)生的主要驅動者,炎-癌分子機制的探討已成為癌變原理研究領域關注的重要焦點。革蘭氏陰性菌是與鼻咽部長期共存的主要病原微生物,是致鼻咽部慢性炎癥的常見因素。如果病原微生物長期持續(xù)刺激鼻炎上皮則會導致鼻咽局部形成慢性炎癥。眾所周知,細菌內毒素即脂多糖(lipopoly saccharide, LPS)是革蘭氏陰性菌主要毒力因素,它可作用于細胞膜受體CD14和TLR4,從而發(fā)揮生物學作用。 SPLUNC1基因作為鼻咽及上呼吸道上皮細胞編碼一種分泌性蛋白,是細胞的固有免疫分子。前期研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1含有一個BPI結構域,BPI能與革蘭氏陰性細菌細胞壁上的LPS特異性地結合。重組的SPLUNC1蛋白能經轉染細胞分泌到培養(yǎng)上清液中并具有結合細菌脂多糖,以及殺滅或抑制上呼吸道綠膿桿菌的功能。SPLUNC1在預防病原微生物感染和抑制過度炎癥反應方面起到重要作用。 本課題將在構建SPLUNC1基因封閉與基因剔除的細胞和動物模型基礎上,深入研究LPS誘導的TLR4/NF-κB信號通路介導的炎癥反應中SPLUNC1預防或阻斷炎-癌反應過程的可能的作用和分子機制,并為鼻咽癌分子診治提供新靶點及新線索。 LPS可通過TLR4/NF-κB信號通路引起鼻咽癌細胞促炎因子的分泌和鼻咽癌細胞的增殖 慢性感染的重要毒力因素被認為是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分LPS,對LPS的識別與信號傳導是宿主細胞抵御革蘭氏陰性細菌的關鍵。同時LPS及其介導的TLR4信號傳導途徑被認為是慢性感染導致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要的因素。為了研究LPS引起的慢性炎癥對鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的影響,本研究采用合適濃度的LPS (1ug/ml)作用于鼻咽癌細胞系5-8F和6-10細胞系。流式細胞周期分析和MTT結果發(fā)現(xiàn)LPS能夠促進鼻咽癌細胞系細胞周期進程進而引起細胞增殖。同時LPS刺激24小時后,Real-time PCR和ELISA檢測促炎因子IL-6, IL-8, TNF-α和IL-1β的表達發(fā)現(xiàn),LPS能夠促進促炎因子的分泌。LPS是TLR4的配體之一。為了w釲PS是否通過TLR4信號通路影響鼻咽癌細胞促炎因子的分泌和細胞增殖,本研究采用Western-blot和Real-time PCR檢測了TLR4信號通路相關分子的表達,結果發(fā)現(xiàn)LPS能顯著提高CD14, TLR4, MyD88,p-p65表達以促進促炎因子的分泌。采用免疫熒光技術和熒光素酶報告基因活性檢測發(fā)現(xiàn),在LPS誘導下,鼻咽癌細胞中NF-KB (p65)被活化進入細胞核內。NF/κB (p65)持續(xù)活化是慢性炎癥發(fā)生的主要因素。因此本文認為：在鼻咽癌細胞中,LPS通過TLR4-MyD88-NF-KB (p65)信號通路來促進NF-κB (p65)的活化入核,導致促炎因子的大量分泌進而導致炎癥的持續(xù)發(fā)生和細胞增殖。 SPLUNC1與TLR4在正常和鼻咽癌患者組織中的動態(tài)表達 前期的研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1在正常鼻咽組織中高表達,而在鼻咽癌患者組織中低表達或者不表達；腫瘤細胞表面表達的TLR4能促進腫瘤的免疫逃逸從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究利用鼻咽癌組織芯片采用免疫組化法觀察了SPLUNC1與TLR4在正常鼻咽組織和鼻咽癌組織中的表達情況,并分析了兩者表達的相關性以及對鼻咽癌患者的預后判斷。結果發(fā)現(xiàn)在正常鼻咽組織中SPLUNC1的高表達,而炎癥組織中SPLUNC1的表達減弱,鼻咽癌組織中SPLUNC1的表達逐漸消失；但是TLR4在正常鼻咽組織中呈弱表達,炎癥組織中TLR4表達升高,且在鼻咽癌組織中呈高表達。相關性分析得出SPLUNC1與TLR4的表達呈負相關關系。Kaplan-Meier生存分析顯示SPLUNC1表達越低,TLR4表達越高,鼻咽癌患者預后越差。 SPLUNC1通過TLR4/NF-KB信號通路抑制LPS引起的促炎因子的分泌和細胞增殖 為了篩選合適的細胞系進行后續(xù)實驗,本研究對鼻咽癌細胞系進行了SPLUNC1和TLR4的表達篩選,Real-time PCR和WB觀察發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細胞系5-8F和正常鼻咽上皮細胞系NP-69較合適進行后續(xù)實驗。SPLUNC1含有BPI結構域,能夠與細菌LPS結合,為了證實SPLUNC1是制約LPS引起的細胞增殖和促炎因子分泌的關鍵因素的設想,本研究構建了穩(wěn)定高表達SPLUNC1的5-8F細胞系和穩(wěn)定干擾SPLUNC1的NP69細胞系,并使用LPS (1ug/ml)刺激5-8F/ctrl和5-8F/SPLUNC1細胞系以及NP-69/Ctrl和NP69/SPLUNC1si細胞系。通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉染SPLUNC1的5-8F細胞系明顯比空載體轉染細胞系增殖慢,同時干擾SPLUNC1的NP69細胞系經LPS刺激后增殖速度比對照組明顯加快。通過流式細胞技術也表明SPLUNC1基因能夠阻止LPS引起的細胞增殖,導致鼻咽癌細胞的生長阻滯在G0/G1期。同時Real-time PCR和ELISA實驗證實,SPLUNC1基因能夠在mRNA水平和蛋白水平抑制LPS引起的促炎因子IL-6, IL-8, TNF-α和IL-1β的分泌。以上結果證實SPLUNC1能夠抑制LPS引起的促炎因子的分泌和鼻咽癌細胞的增殖。因為LPS可通過TLR4-MyD88-NF-κB (p65)信號通路促進鼻咽癌細胞系促炎因子的分泌和細胞增殖,于是本研究進一步驗證了SPLUNC1在這一過程中的作用。使用LPS (1ug/ml)刺激5-8F/ctrl和5-8F/SPLUNC1細胞系以及NP-69/Ctrl和NP69/SPLUNC1si細胞系24小時后,收集蛋白進行Western-blot檢測發(fā)現(xiàn),SPLUNC1能夠抑制LPS引起的TLR4、 MyD88、p-p65(NF-κB)表達的升高。熒光素酶報告基因檢測結果和免疫熒光結果顯示,盡管受到LPS的刺激,SPLUNC1也能阻止NF-κB入核,同時也能抑制NF-κB的轉錄活性。 為了在體內證實SPLUNC1抑制LPS引起的炎癥反應的功能,本研究構建了Splunc1基因敲除小鼠,取Splunc1敲除小鼠和野生型小鼠肺組織和MEF檢測Tlr4/Nf-κb通路關鍵分子的表達,并對Splunc1敲除小鼠和野生型小鼠進行腹腔注射LPS (5mg/kg)刺激24小時后,取小鼠肺組織進行免疫組化檢測,同時收集小鼠外周血進行ELISA檢測。Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)Splunc1敲除后,Splunc1敲除小鼠肺組織和MEF (Splunc1-/-)中Cd14, Tlr4、Myd88、p-p65(Nf-κb)表達的升高而Ikba的表達降低。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)Splunc1敲除小鼠LPS刺激后,外周血中促炎因子11-6,11-8表達升高。 上述研究結果證明SPLUNC1基因可通過降低TLR4表達和抑制NF-κB活化有效抑制LPS引起的促炎因子的分泌和細胞增殖,這為固有免疫分子SPLUNC1能有效抵抗病原微生物感染引起的炎癥反應,維持微環(huán)境的穩(wěn)定提供了有力的證據(jù)。
[Abstract]:It is considered that chronic inflammation is the main driver of malignant tumor in 20 - 25 % . The pathogenesis of inflammatory - cancer has become an important focus in the field of carcinogenesis . Gram - negative bacteria are the main pathogenic microorganisms in the chronic inflammation of nasopharyngeal parts . It is well known that bacterial endotoxin , lipopolysaccharide ( LPS ) , is the main virulence factor of Gram - negative bacteria , which can act on the membrane receptor CD14 and the like receptor , thus exerting a biological function . SPLUNC1 encodes a secretory protein as a secretory protein in the nasopharyngeal and upper respiratory epithelial cells , which is an innate immune molecule of the cell . Previous studies have found that SPLUNC1 contains a protein that binds to LPS on the cell wall of the Gram - negative bacterial cell . The recombinant SPLUNC1 protein can be secreted into the culture supernatant by transfected cells and has the function of binding bacterial lipopolysaccharide , and killing or inhibiting the upper respiratory tract pseudomonas aeruginosa . SPLUNC1 plays an important role in the prevention of pathogenic microbial infections and inhibiting excessive inflammation . On the basis of constructing the cell and animal model of SPLUNC1 gene closure and gene knockout , the possible role and molecular mechanism of SPLUNC1 in preventing or blocking inflammatory - cancer response in inflammatory reaction mediated by LPS - induced TLR / NF - 魏B signaling pathway can be further studied , and new targets and new clues are provided for the diagnosis and treatment of nasopharyngeal carcinoma . LPS can induce the secretion of pro - inflammatory cytokines in nasopharyngeal carcinoma cells and the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells through the signaling pathway of NF - 魏B signaling pathway . LPS and IL - 6 , IL - 8 , TNF - 偽 and IL - 1尾 in nasopharyngeal carcinoma cell line were detected by Western - blot and Real - time PCR . Dynamic expression of SPLUNC1 in normal and nasopharyngeal carcinoma patients The expression of SPLUNC1 in normal nasopharyngeal tissues and the expression of SPLUNC1 in nasopharyngeal carcinoma were observed by immunohistochemistry . The expression of SPLUNC1 was decreased in the normal nasopharyngeal tissues , and the expression of SPLUNC1 in the tissues of NPC was decreased . SPLUNC1 inhibits the secretion of pro - inflammatory cytokines and the proliferation of cells induced by LPS via the Toll - like / NF - KB signaling pathway The results showed that SPLUNC1 could inhibit the secretion of IL - 6 , IL - 8 , TNF - 偽 and IL - 1尾 in nasopharyngeal carcinoma cell line by LPS ( 1ug / ml ) . In order to demonstrate the function of SPLUNC1 in inhibiting the inflammatory response induced by LPS in vivo , we constructed a Spluncl knockout mouse . After 24 hours of intraperitoneal injection of LPS ( 5 mg / kg ) by Spluncl knockout mice and wild - type mice , the expression of Cd14 , Tr4 , Myd88 , p - p65 ( Nf - 魏B ) was detected by Western - blot . Western - blot analysis showed that Spluncl knockout mice stimulated inflammatory factors 11 - 6 and 11 - 8 in peripheral blood after LPS stimulation in mice . These results demonstrate that the SPLUNC1 gene can effectively inhibit the secretion of pro - inflammatory factors induced by LPS and inhibit the proliferation of cells by reducing the expression and inhibition of NF - 魏B activation , which provides powerful evidence for the effective resistance of SPLUNC1 to inflammatory response caused by pathogenic microorganism infection and maintaining the stability of the microenvironment .

【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R739.63

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 李錦添,黃平,肖永波,周昕熙,陳詩萍;細胞周期調節(jié)因子在原發(fā)和復發(fā)鼻咽癌的表達[J];中山醫(yī)科大學學報;2001年03期

2 李杰恩,周永,藍新海,譚頌華,唐安洲,王仁生,馮震博;鼻咽癌組織放療前后細胞增殖凋亡的變化[J];腫瘤;2001年05期

3 汪波,石靈春,譚敏,肖楚梅,周丹;細胞周期調控基因在鼻咽癌發(fā)生中的表達[J];解剖學研究;2001年03期

4 陳淑勤,黃培生,李一偉,高凌云,王鏞;尿激酶型纖溶酶原激活物在鼻咽癌的表達及臨床意義[J];福建醫(yī)科大學學報;2002年01期

5 郜紅藝,吳秋良,張玉;鼻咽癌預后相關的病理學研究[J];廣東醫(yī)學;2002年04期

6 周小軍 ,田道法;鼻咽癌高危人群病理特征研究進展[J];廣西醫(yī)學;2002年05期

7 陳斌,殷善開;鼻咽癌的病因和流行病學狀況[J];中國全科醫(yī)學;2002年04期

8 賀智敏,王水良,袁建輝,陳主初;人細胞色素P450 2E1基因在胚胎鼻咽組織、鼻咽癌細胞和組織中的表達[J];癌癥;2002年06期

9 張明,劉立思,程磊;熱休克蛋白60表達和一氧化氮在鼻咽癌中的意義[J];華中科技大學學報(醫(yī)學版);2003年06期

10 王茂鑫;;鼻咽癌組織中凋亡相關基因蛋白表達及其意義[J];福州總醫(yī)院學報;2004年04期

相關會議論文 前10條

1 符生苗;梁茱;董玉英;;鼻咽癌的P_(16)基因表達分析[A];面向21世紀的科技進步與社會經濟發(fā)展（下冊）[C];1999年

2 劉青;王雅棣;景尚華;王曉玲;程云杰;吳鳳鵬;;E-鈣粘蛋白在鼻咽癌組織中的表達水平與頸部淋巴結轉移的關系[A];中華醫(yī)學會放射腫瘤治療學分會六屆二次暨中國抗癌協(xié)會腫瘤放療專業(yè)委員會二屆二次學術會議論文集[C];2009年

3 邵建永;王海云;朱志華;孫炳宇;陳靜;杜子明;張家興;邵瓊;黃馬燕;符珈;廖定準;侯景輝;盧泰祥;葉偉民;Ingemar Ernberg;曾益新;;鼻咽癌分子分型研究[A];中華醫(yī)學會病理學分會2010年學術年會日程及論文匯編[C];2010年

4 王樹森;管忠震;向燕群;汪波;林桐榆;姜文奇;張力;張惠忠;侯景輝;;鼻咽癌組織中EGFR信號傳導通路相關分子的表達[A];第三屆中國腫瘤學術大會教育論文集[C];2004年

5 陳顯釗;;鼻咽癌診治研究進展[A];海南省第二屆腫瘤學術會議論文集[C];2005年

6 林少民;唐啟信;;鼻咽癌家族腫瘤史115例調查分析[A];海南省第二屆腫瘤學術會議論文集[C];2005年

7 邵世宏;姚運紅;;鼻咽癌腫瘤干細胞及其表面標志物初步研究[A];中華醫(yī)學會病理學分會2006年學術年會論文匯編[C];2006年

8 李菊蘭;蔡華成;梁傳余;韓偉;;生長抑素Ⅱ型受體在鼻咽癌組織中的表達[A];中華醫(yī)學會第十次全國耳鼻咽喉-頭頸外科學術會議論文匯編（下）[C];2007年

9 項光早;;微血管密度與鼻咽癌生長、浸潤、轉移和預后關系的研究[A];浙江省醫(yī)學會耳鼻咽喉科學分會成立60周年慶典暨2011年浙江省醫(yī)學會耳鼻咽喉頭頸外科學學術年會論文匯編[C];2011年

10 潘建基;;鼻咽癌臨床診治現(xiàn)狀和進展[A];中國腫瘤內科進展 中國腫瘤醫(yī)師教育（2014）[C];2014年

相關重要報紙文章 前6條

1 湯清波邋李奇 劉齡予;挑戰(zhàn)“鼻咽癌”的人[N];大眾衛(wèi)生報;2007年

2 本報記者　 盧育輝;崇尚“紅�！本�,喜歡“咖啡”會友[N];廣東科技報;2006年

3 本報記者　 羅艾樺;挑戰(zhàn)“廣東癌”[N];人民日報;2006年

4 仁華南;“回國發(fā)展是一項明智的選擇”[N];人民日報海外版;2006年

5 本報記者 謝明霞;從蛋白質組學入手 探究鼻咽癌[N];健康報;2011年

6 廣東省第二人民醫(yī)院 主任醫(yī)師 蔡長青;病毒與某些癌癥[N];家庭醫(yī)生報;2005年

相關博士學位論文 前10條

1 周文;鼻咽癌染色體12p12-11區(qū)段擴增基因的篩選及其功能研究[D];中南大學;2010年

2 覃綱;免疫球蛋白M與鼻咽癌的實驗研究[D];四川大學;2007年

3 鄭英;基于鼻咽癌潛在靶標的活體光學成像與靶向治療研究[D];華中科技大學;2012年

4 鄧鵬;鐵皮石斛抗鼻咽癌的作用研究[D];廣西醫(yī)科大學;2010年

5 俞艷萍;ABCG2在鼻咽癌中的表達及其在鼻咽癌化療中的作用[D];華中科技大學;2010年

6 陳舒華;鼻咽癌高癌家系體質證型的蛋白質組學研究[D];湖南中醫(yī)藥大學;2008年

7 何英;7個鼻咽癌相關基因單核苷酸多態(tài)性的篩查及其與鼻咽癌易感性的關聯(lián)分析[D];中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學;2003年

8 王路;EBNA1在鼻咽癌轉移中的作用及分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2011年

9 樓建軍;抑癌基因單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌遺傳易感性研究[D];廣西醫(yī)科大學;2012年

10 張e，

本文編號：1548674