本文關(guān)鍵詞： 鼻咽癌 SPLUNC1 TLR4 NF-κB 炎癥　出處：《中南大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目前認(rèn)為慢性炎癥是20-25%的惡性腫瘤發(fā)生的主要驅(qū)動者,炎-癌分子機(jī)制的探討已成為癌變原理研究領(lǐng)域關(guān)注的重要焦點。革蘭氏陰性菌是與鼻咽部長期共存的主要病原微生物,是致鼻咽部慢性炎癥的常見因素。如果病原微生物長期持續(xù)刺激鼻炎上皮則會導(dǎo)致鼻咽局部形成慢性炎癥。眾所周知,細(xì)菌內(nèi)毒素即脂多糖(lipopoly saccharide, LPS)是革蘭氏陰性菌主要毒力因素,它可作用于細(xì)胞膜受體CD14和TLR4,從而發(fā)揮生物學(xué)作用。 SPLUNC1基因作為鼻咽及上呼吸道上皮細(xì)胞編碼一種分泌性蛋白,是細(xì)胞的固有免疫分子。前期研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1含有一個BPI結(jié)構(gòu)域,BPI能與革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的LPS特異性地結(jié)合。重組的SPLUNC1蛋白能經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上清液中并具有結(jié)合細(xì)菌脂多糖,以及殺滅或抑制上呼吸道綠膿桿菌的功能。SPLUNC1在預(yù)防病原微生物感染和抑制過度炎癥反應(yīng)方面起到重要作用。 本課題將在構(gòu)建SPLUNC1基因封閉與基因剔除的細(xì)胞和動物模型基礎(chǔ)上,深入研究LPS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中SPLUNC1預(yù)防或阻斷炎-癌反應(yīng)過程的可能的作用和分子機(jī)制,并為鼻咽癌分子診治提供新靶點及新線索。 LPS可通過TLR4/NF-κB信號通路引起鼻咽癌細(xì)胞促炎因子的分泌和鼻咽癌細(xì)胞的增殖 慢性感染的重要毒力因素被認(rèn)為是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分LPS,對LPS的識別與信號傳導(dǎo)是宿主細(xì)胞抵御革蘭氏陰性細(xì)菌的關(guān)鍵。同時LPS及其介導(dǎo)的TLR4信號傳導(dǎo)途徑被認(rèn)為是慢性感染導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要的因素。為了研究LPS引起的慢性炎癥對鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的影響,本研究采用合適濃度的LPS (1ug/ml)作用于鼻咽癌細(xì)胞系5-8F和6-10細(xì)胞系。流式細(xì)胞周期分析和MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞系細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)而引起細(xì)胞增殖。同時LPS刺激24小時后,Real-time PCR和ELISA檢測促炎因子IL-6, IL-8, TNF-α和IL-1β的表達(dá)發(fā)現(xiàn),LPS能夠促進(jìn)促炎因子的分泌。LPS是TLR4的配體之一。為了w釲PS是否通過TLR4信號通路影響鼻咽癌細(xì)胞促炎因子的分泌和細(xì)胞增殖,本研究采用Western-blot和Real-time PCR檢測了TLR4信號通路相關(guān)分子的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS能顯著提高CD14, TLR4, MyD88,p-p65表達(dá)以促進(jìn)促炎因子的分泌。采用免疫熒光技術(shù)和熒光素酶報告基因活性檢測發(fā)現(xiàn),在LPS誘導(dǎo)下,鼻咽癌細(xì)胞中NF-KB (p65)被活化進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。NF/κB (p65)持續(xù)活化是慢性炎癥發(fā)生的主要因素。因此本文認(rèn)為：在鼻咽癌細(xì)胞中,LPS通過TLR4-MyD88-NF-KB (p65)信號通路來促進(jìn)NF-κB (p65)的活化入核,導(dǎo)致促炎因子的大量分泌進(jìn)而導(dǎo)致炎癥的持續(xù)發(fā)生和細(xì)胞增殖。 SPLUNC1與TLR4在正常和鼻咽癌患者組織中的動態(tài)表達(dá) 前期的研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1在正常鼻咽組織中高表達(dá),而在鼻咽癌患者組織中低表達(dá)或者不表達(dá)；腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的TLR4能促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究利用鼻咽癌組織芯片采用免疫組化法觀察了SPLUNC1與TLR4在正常鼻咽組織和鼻咽癌組織中的表達(dá)情況,并分析了兩者表達(dá)的相關(guān)性以及對鼻咽癌患者的預(yù)后判斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常鼻咽組織中SPLUNC1的高表達(dá),而炎癥組織中SPLUNC1的表達(dá)減弱,鼻咽癌組織中SPLUNC1的表達(dá)逐漸消失；但是TLR4在正常鼻咽組織中呈弱表達(dá),炎癥組織中TLR4表達(dá)升高,且在鼻咽癌組織中呈高表達(dá)。相關(guān)性分析得出SPLUNC1與TLR4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Kaplan-Meier生存分析顯示SPLUNC1表達(dá)越低,TLR4表達(dá)越高,鼻咽癌患者預(yù)后越差。 SPLUNC1通過TLR4/NF-KB信號通路抑制LPS引起的促炎因子的分泌和細(xì)胞增殖 為了篩選合適的細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實驗,本研究對鼻咽癌細(xì)胞系進(jìn)行了SPLUNC1和TLR4的表達(dá)篩選,Real-time PCR和WB觀察發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞系5-8F和正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP-69較合適進(jìn)行后續(xù)實驗。SPLUNC1含有BPI結(jié)構(gòu)域,能夠與細(xì)菌LPS結(jié)合,為了證實SPLUNC1是制約LPS引起的細(xì)胞增殖和促炎因子分泌的關(guān)鍵因素的設(shè)想,本研究構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)SPLUNC1的5-8F細(xì)胞系和穩(wěn)定干擾SPLUNC1的NP69細(xì)胞系,并使用LPS (1ug/ml)刺激5-8F/ctrl和5-8F/SPLUNC1細(xì)胞系以及NP-69/Ctrl和NP69/SPLUNC1si細(xì)胞系。通過MTT實驗發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SPLUNC1的5-8F細(xì)胞系明顯比空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系增殖慢,同時干擾SPLUNC1的NP69細(xì)胞系經(jīng)LPS刺激后增殖速度比對照組明顯加快。通過流式細(xì)胞技術(shù)也表明SPLUNC1基因能夠阻止LPS引起的細(xì)胞增殖,導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞的生長阻滯在G0/G1期。同時Real-time PCR和ELISA實驗證實,SPLUNC1基因能夠在mRNA水平和蛋白水平抑制LPS引起的促炎因子IL-6, IL-8, TNF-α和IL-1β的分泌。以上結(jié)果證實SPLUNC1能夠抑制LPS引起的促炎因子的分泌和鼻咽癌細(xì)胞的增殖。因為LPS可通過TLR4-MyD88-NF-κB (p65)信號通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞系促炎因子的分泌和細(xì)胞增殖,于是本研究進(jìn)一步驗證了SPLUNC1在這一過程中的作用。使用LPS (1ug/ml)刺激5-8F/ctrl和5-8F/SPLUNC1細(xì)胞系以及NP-69/Ctrl和NP69/SPLUNC1si細(xì)胞系24小時后,收集蛋白進(jìn)行Western-blot檢測發(fā)現(xiàn),SPLUNC1能夠抑制LPS引起的TLR4、 MyD88、p-p65(NF-κB)表達(dá)的升高。熒光素酶報告基因檢測結(jié)果和免疫熒光結(jié)果顯示,盡管受到LPS的刺激,SPLUNC1也能阻止NF-κB入核,同時也能抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。 為了在體內(nèi)證實SPLUNC1抑制LPS引起的炎癥反應(yīng)的功能,本研究構(gòu)建了Splunc1基因敲除小鼠,取Splunc1敲除小鼠和野生型小鼠肺組織和MEF檢測Tlr4/Nf-κb通路關(guān)鍵分子的表達(dá),并對Splunc1敲除小鼠和野生型小鼠進(jìn)行腹腔注射LPS (5mg/kg)刺激24小時后,取小鼠肺組織進(jìn)行免疫組化檢測,同時收集小鼠外周血進(jìn)行ELISA檢測。Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)Splunc1敲除后,Splunc1敲除小鼠肺組織和MEF (Splunc1-/-)中Cd14, Tlr4、Myd88、p-p65(Nf-κb)表達(dá)的升高而Ikba的表達(dá)降低。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)Splunc1敲除小鼠LPS刺激后,外周血中促炎因子11-6,11-8表達(dá)升高。 上述研究結(jié)果證明SPLUNC1基因可通過降低TLR4表達(dá)和抑制NF-κB活化有效抑制LPS引起的促炎因子的分泌和細(xì)胞增殖,這為固有免疫分子SPLUNC1能有效抵抗病原微生物感染引起的炎癥反應(yīng),維持微環(huán)境的穩(wěn)定提供了有力的證據(jù)。
[Abstract]:It is considered that chronic inflammation is the main driver of malignant tumor in 20 - 25 % . The pathogenesis of inflammatory - cancer has become an important focus in the field of carcinogenesis . Gram - negative bacteria are the main pathogenic microorganisms in the chronic inflammation of nasopharyngeal parts . It is well known that bacterial endotoxin , lipopolysaccharide ( LPS ) , is the main virulence factor of Gram - negative bacteria , which can act on the membrane receptor CD14 and the like receptor , thus exerting a biological function . SPLUNC1 encodes a secretory protein as a secretory protein in the nasopharyngeal and upper respiratory epithelial cells , which is an innate immune molecule of the cell . Previous studies have found that SPLUNC1 contains a protein that binds to LPS on the cell wall of the Gram - negative bacterial cell . The recombinant SPLUNC1 protein can be secreted into the culture supernatant by transfected cells and has the function of binding bacterial lipopolysaccharide , and killing or inhibiting the upper respiratory tract pseudomonas aeruginosa . SPLUNC1 plays an important role in the prevention of pathogenic microbial infections and inhibiting excessive inflammation . On the basis of constructing the cell and animal model of SPLUNC1 gene closure and gene knockout , the possible role and molecular mechanism of SPLUNC1 in preventing or blocking inflammatory - cancer response in inflammatory reaction mediated by LPS - induced TLR / NF - 魏B signaling pathway can be further studied , and new targets and new clues are provided for the diagnosis and treatment of nasopharyngeal carcinoma . LPS can induce the secretion of pro - inflammatory cytokines in nasopharyngeal carcinoma cells and the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells through the signaling pathway of NF - 魏B signaling pathway . LPS and IL - 6 , IL - 8 , TNF - 偽 and IL - 1尾 in nasopharyngeal carcinoma cell line were detected by Western - blot and Real - time PCR . Dynamic expression of SPLUNC1 in normal and nasopharyngeal carcinoma patients The expression of SPLUNC1 in normal nasopharyngeal tissues and the expression of SPLUNC1 in nasopharyngeal carcinoma were observed by immunohistochemistry . The expression of SPLUNC1 was decreased in the normal nasopharyngeal tissues , and the expression of SPLUNC1 in the tissues of NPC was decreased . SPLUNC1 inhibits the secretion of pro - inflammatory cytokines and the proliferation of cells induced by LPS via the Toll - like / NF - KB signaling pathway The results showed that SPLUNC1 could inhibit the secretion of IL - 6 , IL - 8 , TNF - 偽 and IL - 1尾 in nasopharyngeal carcinoma cell line by LPS ( 1ug / ml ) . In order to demonstrate the function of SPLUNC1 in inhibiting the inflammatory response induced by LPS in vivo , we constructed a Spluncl knockout mouse . After 24 hours of intraperitoneal injection of LPS ( 5 mg / kg ) by Spluncl knockout mice and wild - type mice , the expression of Cd14 , Tr4 , Myd88 , p - p65 ( Nf - 魏B ) was detected by Western - blot . Western - blot analysis showed that Spluncl knockout mice stimulated inflammatory factors 11 - 6 and 11 - 8 in peripheral blood after LPS stimulation in mice . These results demonstrate that the SPLUNC1 gene can effectively inhibit the secretion of pro - inflammatory factors induced by LPS and inhibit the proliferation of cells by reducing the expression and inhibition of NF - 魏B activation , which provides powerful evidence for the effective resistance of SPLUNC1 to inflammatory response caused by pathogenic microorganism infection and maintaining the stability of the microenvironment .

【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R739.63

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本文編號：1548674