本文關(guān)鍵詞： 綜合征型聾 耳聾-甲發(fā)育不全（DDOD）綜合征 ATP6V1B2基因 基因突變 內(nèi)耳發(fā)育 非綜合征型聾 云南 少數(shù)民族　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分DDOD綜合征致病機(jī)制研究 背景DDOD綜合征是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。已明確該綜合征的責(zé)任基因為ATP6V1B2，其致病機(jī)制尚不清楚。為了進(jìn)一步明確DDOD綜合征的致病機(jī)制，我們對山西的一個DDOD綜合征家系進(jìn)行了分子致病機(jī)制的研究。方法通過對DDOD綜合征家系的先證者及其家人進(jìn)行Sanger測序明確DDOD綜合征的責(zé)任基因突變，通過相對定量PCR研究ATP6V1B2的轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果先證者攜帶有ATP6V1B2的新生無義突變c.1516CT，其父母及弟弟均未攜帶該突變。相對定量PCR研究中，先證者與其父母相比，轉(zhuǎn)錄水平無明顯改變，與其弟弟相比，轉(zhuǎn)錄水平有差異。結(jié)論證實該DDOD綜合征家系的致病原因為ATP6V1B2第14外顯子發(fā)生了新生無義突變c.1516CT。且基因突變后轉(zhuǎn)錄水平無明顯改變。 第二部分ATP6V1B2突變的致聾機(jī)制研究 背景ATP6V1B2編碼的蛋白ATP6V1B2為ATPase的一個亞基，在人體廣泛表達(dá)，已證實ATP6V1B2的突變?yōu)镈DOD綜合征的主要致病原因，其發(fā)病機(jī)制不清楚。為了進(jìn)一步明確ATP6V1B2在聽覺形成中的作用。我們在mRNA水平及蛋白水平對不同發(fā)育階段的小鼠耳蝸進(jìn)行了研究。方法選用不同發(fā)育階段（E17，E19，P1，P7，P14，P21，P30）的小鼠，取出耳蝸，行冰凍切片，采用免疫組化法及免疫熒光染色法研究Atp6vb2在小鼠內(nèi)耳聽覺器官發(fā)育過程中的蛋白表達(dá)。采用原位雜交方法研究Atp6vb2在小鼠內(nèi)耳聽覺器官發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄水平變化。構(gòu)建野生型與突變型ATP6V1B2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，鑒定ATPase的水解活性及轉(zhuǎn)運功能。結(jié)果免疫熒光法顯示：ATP6V1B2在昆明小鼠耳蝸Corti’s器的內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)上均有明顯表達(dá)，在內(nèi)外毛細(xì)胞上的熒光與MYO7A的熒光相吻合，在螺旋神經(jīng)節(jié)上的綠色熒光與Neurofilament的熒光位置相吻合。小鼠內(nèi)耳發(fā)育過程中ATP6V1B2表達(dá)位置比較恒定。采用免疫組化法檢測了ATP6V1B2在昆明小鼠耳蝸的表達(dá)分布情況。結(jié)果與免疫熒光染色結(jié)果一致。均表現(xiàn)為在小鼠耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)存在ATP6V1B2表達(dá)。探針組螺旋神經(jīng)節(jié)及內(nèi)外毛細(xì)胞染色較深，陰性對照未著色。說明在mRNA水平，ATP6V1B2在出生后第二天的昆明小鼠耳蝸的螺旋神經(jīng)節(jié)及內(nèi)外毛細(xì)胞有表達(dá)，這與我們之前的免疫組化的結(jié)果相吻合。ATPase的實驗顯示隨著突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例的提高，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的ATPase的水解活性顯著減低。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的溶酶體pH值在增加，說明隨著突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例的提高，ATPase質(zhì)子泵的轉(zhuǎn)運活力在下降。結(jié)論通過對不同發(fā)育階段的小鼠耳蝸切片進(jìn)行免疫熒光及免疫組化染色，在蛋白水平明確了ATP6V1B2在小鼠耳蝸表達(dá)，主要表達(dá)部位為耳蝸的內(nèi)外毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)、神經(jīng)元；在小鼠耳蝸的發(fā)育過程中，ATP6V1B2表達(dá)部位穩(wěn)定，說明Atp6v1b2在聽覺形成中具有重要的功能。通過RNA原位雜交，首次在mRNA水平證實Atp6v1b2在小鼠耳蝸表達(dá)，表達(dá)部位為耳蝸的內(nèi)外毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)節(jié)，與免疫組化及免疫熒光的實驗結(jié)果相一致。通過構(gòu)建ATP6V1B2基因野生型、c.1516CT突變型和PEGFP基因的真核共表達(dá)載體，，并轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，進(jìn)一步對V-ATPase的水解及轉(zhuǎn)運活性鑒定，發(fā)現(xiàn)隨著突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例的提高，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的ATPase的水解活性顯著減低。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的溶酶體pH值在增加，說明隨著突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例的提高，ATPase質(zhì)子泵的轉(zhuǎn)運活力在下降。在功能學(xué)上初步證實該突變能影響V-ATPase的水解活性，繼而影響靠ATP水解提供能量進(jìn)行的H+離子轉(zhuǎn)運功能，造成溶酶體內(nèi)酸度減低。 第三部分西南地區(qū)非綜合征型聾分子流行病學(xué)研究背景在我國，每年有30,000個聾兒出生。位于中國西南部的云南，由52個民族組成，是人類文明的重要起源地，對該地區(qū)耳聾致病因素知之甚少。為該區(qū)域的耳聾患者及其家人提供有效的耳聾風(fēng)險評估和基因咨詢，我們對云南省華夏中專特教學(xué)校非綜合征型耳聾患者的常見分子病因進(jìn)行了調(diào)查。方法對云南省華夏中專特教學(xué)校的235名耳聾患者的GJB2、SLC26A4和mtDNA12S rRNA突變進(jìn)行了分析。并對包括攜帶有SLC26A4突變的16例患者、未攜帶任何SLC26A4突變的37例少數(shù)民族和47例漢族在內(nèi)的共100例患者進(jìn)行顳骨CT掃描。結(jié)果GJB2在少數(shù)民族的檢出率為16.67%(7/42)，漢族的檢出率為17.62%(34/193)，二者沒有明顯差異(P0.05)。235delC為非綜合征型聾的熱點突變。首次在漢族非綜合征型聾患者中發(fā)現(xiàn)了431_450del19突變，其使終止密碼子提前出現(xiàn)，蛋白結(jié)構(gòu)改變。SLC26A4在少數(shù)民族的檢出率為9.52%(4/42)，漢族的檢出率為9.84%(19/193)，兩組沒有明顯差異（P0.05）。mtDNA12S rRNA在少數(shù)民族和漢族的檢出率分別為11.90%(5/42)和7.77%(15/193)，二者相比沒有明顯差異（P0.05）。在16例攜帶有SLC26A4突變進(jìn)行CT掃描的患者中，14例被診斷為EVAS；另2例不伴有內(nèi)耳畸形。EVAs在少數(shù)民族中的檢出率為14.63%(6/41)。結(jié)論本研究中，基因突變陽性檢出率為35.74%，其中GJB2、SLC26A4和mtDNA1555AG檢出率分別為17.45%、9.79%和8.51%。云南少數(shù)民族和漢族的耳聾相關(guān)基因突變譜及檢出率沒有明顯差異。
[Abstract]:Study on the Pathogenesis of the First Part of Ddod Syndrome In order to further clarify the pathogenesis of Dod syndrome , we investigated the genetic mutation of ATP6V1B2 by Sanger sequencing . Study on the mechanism of deafness caused by mutation of ATP6V1B2 in the second part The expression of ATP6V1B2 in mouse cochlea was studied by immunohistochemistry and immunofluorescence staining . The H + ion transport function is then affected by ATP hydrolysis , resulting in a decrease in the acidity of lysosomes . The prevalence of GJB2 , SLC26A4 and mtDNA1555AG was 11.90 % ( 5 / 42 ) and 7.77 % ( 15 / 193 ) respectively .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R764.43

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊揮,張玲,張旭家,黃有國;豬心線粒體F_o的純化、重建及其質(zhì)子轉(zhuǎn)運功能[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2001年02期

本文編號：1543210