本文關(guān)鍵詞： 角膜緣干細(xì)胞 Venus熒光蛋白 熒光角膜上皮植片 角膜緣干細(xì)胞移植　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2010年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】： 角膜緣干細(xì)胞(LSCs)是角膜上皮再生與修復(fù)的來(lái)源。許多角膜疾病是由于角膜緣干細(xì)胞缺失(LSCD)引發(fā)的。目前國(guó)內(nèi)外許多研究者通過(guò)角膜緣干細(xì)胞移植術(shù)(LSCT)治愈受損的角膜上皮,并且取得良好的治愈效果,但是關(guān)于角膜緣干細(xì)胞移植受損機(jī)體后的修復(fù)機(jī)理并不明確。為了揭示角膜緣干細(xì)胞移植后移行及修復(fù)變化,本研究分離培養(yǎng)原代山羊角膜緣干細(xì)胞(GLSCs),并標(biāo)記venus熒光基因建立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株(GLSC-V),以角膜緣干細(xì)胞熒光蛋白(Venus)細(xì)胞株為種子細(xì)胞組織工程化構(gòu)建成熒光角膜上皮植片并移植于缺失角膜上皮山羊眼表,最后對(duì)重建的角膜上皮進(jìn)行相關(guān)性檢測(cè),為研究角膜緣干細(xì)胞修復(fù)嚴(yán)重受損角膜上皮機(jī)理奠定基礎(chǔ)。本研究主要內(nèi)容如下: 1.山羊角膜緣干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定 本研究首先體外分離山羊角膜緣上皮組織,依次使用Dispase II酶及胰酶處理上皮組織獲得角膜緣上皮單細(xì)胞,再使用20 min Collagen IV快速粘附法部分富集GLSCs。體外擴(kuò)增的GLSCs的生長(zhǎng)特性與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致,免疫化學(xué)及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明分離純化的GLSC未分化且具有高增殖能力,可用于后期轉(zhuǎn)基因工作。 2.山羊角膜緣干細(xì)胞熒光蛋白(Venus)細(xì)胞株的建立 本研究使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法對(duì)GLSCs進(jìn)行pVenus轉(zhuǎn)染,并使用最佳濃度的G418 (500μg/mL)培養(yǎng)液篩選獲得穩(wěn)定傳代的Venus熒光蛋白細(xì)胞株(GLSC-V)。GLSC-V具有與GLSCs相同的生理特性。熒光倒置顯微鏡下觀察Venus在細(xì)胞質(zhì)和核中均表達(dá)綠色熒光,熒光在體外培養(yǎng)可至少持續(xù)3個(gè)月。免疫熒光及半定量RT-PCR檢測(cè)GLSC-V低分化且有高增殖能力,可作為組織工程化角膜上皮的種子細(xì)胞。 3.熒光角膜上皮植片的構(gòu)建、移植及檢測(cè) 本研究以GLSC-V為種子細(xì)胞接種于去上皮羊膜上,體外培養(yǎng)15~21天構(gòu)建成熒光角膜上皮植片。HE染色觀察該熒光角膜上皮植片具有與正常角膜上皮相似的組織結(jié)構(gòu)。透射電鏡觀察熒光角膜上皮細(xì)胞間形成緊密橋粒聯(lián)結(jié),細(xì)胞核大,核仁突出,細(xì)胞核附近富集張力絲。免疫熒光檢測(cè)熒光角膜上皮組織僅基底部最基層細(xì)胞表達(dá)P63,上表皮及中間層細(xì)胞不表達(dá)P63,這與正常角膜緣中干細(xì)胞分布特征相似。將構(gòu)建成功的熒光角膜上皮植片移植于山羊角膜上皮缺失模型上。術(shù)后實(shí)行4個(gè)月臨床觀察:實(shí)驗(yàn)組山羊眼表的鼻、顳兩側(cè)角膜邊緣最先復(fù)明,然后透亮區(qū)域逐漸從鼻、顳兩側(cè)角膜周邊向中央及上、下兩側(cè)周邊擴(kuò)張。實(shí)驗(yàn)組山羊眼表67%有效復(fù)明(2/3),33%部分復(fù)明(1/3),陰性對(duì)照組山羊眼表,角膜結(jié)膜化、血管化。HE染色觀察,重建的角膜緣、角膜周邊及角膜中央修復(fù)部分細(xì)胞與正常角膜上皮組織結(jié)構(gòu)相似,但重建的角膜上皮層數(shù)分布不均勻,中央角膜上皮未修復(fù)的部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。免疫熒光檢測(cè)角膜緣及中央角膜部的P63表達(dá)情況,結(jié)果表明重建的角膜和正常角膜上皮一樣最表層細(xì)胞是終末分化細(xì)胞;重建角膜緣基底層和中間層干細(xì)胞分布不均勻;正常角膜中央細(xì)胞基底層和中間層細(xì)胞僅有少量干細(xì)胞存在,而重建中央角膜上皮基底層和中間層干細(xì)胞較多。 對(duì)重建角膜上皮的不同區(qū)域細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR及免疫熒光檢測(cè)Venus,結(jié)果表明供體細(xì)胞在角膜中央部最多,角膜緣部最少,結(jié)膜部也能檢測(cè)到Venus表達(dá)。 綜合以上研究結(jié)果可推測(cè),角膜上皮供體細(xì)胞移植后不僅存在于重建角膜上皮中,而且也向結(jié)膜上移行。角膜修復(fù)機(jī)制可能是供體細(xì)胞主要完成角膜上表皮的重建,并在一段時(shí)間內(nèi)不被受體細(xì)胞替代;受體與供體高增殖細(xì)胞共同參與角膜上皮的修復(fù),隨著角膜修復(fù)進(jìn)行,受體細(xì)胞從角膜緣開(kāi)始逐漸替代供體細(xì)胞,并且角膜上皮的修復(fù)與更新是共同發(fā)生的。
[Abstract]:Corneal limbal stem cells ( LSCs ) are the source of corneal epithelium regeneration and repair . Many corneal diseases are caused by the absence of corneal limbal stem cells ( LSCD ) . Many researchers at home and abroad have successfully cured the damaged corneal epithelium by limbal stem cell transplantation ( LSCT ) . 1 . Isolation , Culture and Identification of Goat Cornea Stem Cells The results showed that GLSCs isolated and purified were undifferentiated and had high proliferative capacity and could be used in post - transgenic work . 2 . Establishment of fluorescence protein ( Venus ) cell line of goat corneal limbal stem cells GLSC - V was transfected with pVenus by liposome transfection method , and the optimal concentration of G418 ( 500 渭g / mL ) was used to screen the same physiological characteristics . GLSC - V had the same physiological characteristics as GLSCs . 3 . Construction , transplantation and detection of fluorescent corneal epithelium graft In this study , we observed the expression of P63 , epithelial and central corneal epithelium in the corneal epithelium of the experimental group . The results showed that the reconstructed cornea and the normal corneal epithelium were the same as the normal corneal epithelium . The results showed that the reconstructed cornea and the normal corneal epithelium were not uniform . The results showed that the reconstructed cornea and the normal corneal epithelium were not uniform . The basal and middle layer cells of the normal cornea were only in the presence of small amount of stem cells , but the central corneal epithelium and the middle layer stem cells were reconstructed . The expression of Venus was detected by RT - PCR and immunofluorescence in different regions of corneal epithelium . It is speculated that the corneal epithelium donor cells are not only present in the reconstruction of the corneal epithelium but also to the conjunctiva . The mechanism of corneal repair may be that the donor cells mainly finish the reconstruction of the upper epidermis of the cornea and are not replaced by somatic cells for a period of time ; the receptor and the donor high - proliferative cells are involved in the repair of the corneal epithelium , and the recipient cells gradually replace the donor cells from the corneal margin with the repair of the cornea , and the repair and renewal of the corneal epithelium occur together .

【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R779.6

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本文編號(hào)：1538049