發(fā)布時間：2018-02-26 12:39

  本文關鍵詞： 角膜緣干細胞 Venus熒光蛋白 熒光角膜上皮植片 角膜緣干細胞移植　出處：《西北農林科技大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 角膜緣干細胞(LSCs)是角膜上皮再生與修復的來源。許多角膜疾病是由于角膜緣干細胞缺失(LSCD)引發(fā)的。目前國內外許多研究者通過角膜緣干細胞移植術(LSCT)治愈受損的角膜上皮,并且取得良好的治愈效果,但是關于角膜緣干細胞移植受損機體后的修復機理并不明確。為了揭示角膜緣干細胞移植后移行及修復變化,本研究分離培養(yǎng)原代山羊角膜緣干細胞(GLSCs),并標記venus熒光基因建立轉基因細胞株(GLSC-V),以角膜緣干細胞熒光蛋白(Venus)細胞株為種子細胞組織工程化構建成熒光角膜上皮植片并移植于缺失角膜上皮山羊眼表,最后對重建的角膜上皮進行相關性檢測,為研究角膜緣干細胞修復嚴重受損角膜上皮機理奠定基礎。本研究主要內容如下: 1.山羊角膜緣干細胞分離、培養(yǎng)及鑒定 本研究首先體外分離山羊角膜緣上皮組織,依次使用Dispase II酶及胰酶處理上皮組織獲得角膜緣上皮單細胞,再使用20 min Collagen IV快速粘附法部分富集GLSCs。體外擴增的GLSCs的生長特性與國內外報道一致,免疫化學及RT-PCR檢測結果表明分離純化的GLSC未分化且具有高增殖能力,可用于后期轉基因工作。 2.山羊角膜緣干細胞熒光蛋白(Venus)細胞株的建立 本研究使用脂質體轉染方法對GLSCs進行pVenus轉染,并使用最佳濃度的G418 (500μg/mL)培養(yǎng)液篩選獲得穩(wěn)定傳代的Venus熒光蛋白細胞株(GLSC-V)。GLSC-V具有與GLSCs相同的生理特性。熒光倒置顯微鏡下觀察Venus在細胞質和核中均表達綠色熒光,熒光在體外培養(yǎng)可至少持續(xù)3個月。免疫熒光及半定量RT-PCR檢測GLSC-V低分化且有高增殖能力,可作為組織工程化角膜上皮的種子細胞。 3.熒光角膜上皮植片的構建、移植及檢測 本研究以GLSC-V為種子細胞接種于去上皮羊膜上,體外培養(yǎng)15~21天構建成熒光角膜上皮植片。HE染色觀察該熒光角膜上皮植片具有與正常角膜上皮相似的組織結構。透射電鏡觀察熒光角膜上皮細胞間形成緊密橋粒聯(lián)結,細胞核大,核仁突出,細胞核附近富集張力絲。免疫熒光檢測熒光角膜上皮組織僅基底部最基層細胞表達P63,上表皮及中間層細胞不表達P63,這與正常角膜緣中干細胞分布特征相似。將構建成功的熒光角膜上皮植片移植于山羊角膜上皮缺失模型上。術后實行4個月臨床觀察:實驗組山羊眼表的鼻、顳兩側角膜邊緣最先復明,然后透亮區(qū)域逐漸從鼻、顳兩側角膜周邊向中央及上、下兩側周邊擴張。實驗組山羊眼表67%有效復明(2/3),33%部分復明(1/3),陰性對照組山羊眼表,角膜結膜化、血管化。HE染色觀察,重建的角膜緣、角膜周邊及角膜中央修復部分細胞與正常角膜上皮組織結構相似,但重建的角膜上皮層數分布不均勻,中央角膜上皮未修復的部分細胞形態(tài)不規(guī)則。免疫熒光檢測角膜緣及中央角膜部的P63表達情況,結果表明重建的角膜和正常角膜上皮一樣最表層細胞是終末分化細胞;重建角膜緣基底層和中間層干細胞分布不均勻;正常角膜中央細胞基底層和中間層細胞僅有少量干細胞存在,而重建中央角膜上皮基底層和中間層干細胞較多。 對重建角膜上皮的不同區(qū)域細胞進行RT-PCR及免疫熒光檢測Venus,結果表明供體細胞在角膜中央部最多,角膜緣部最少,結膜部也能檢測到Venus表達。 綜合以上研究結果可推測,角膜上皮供體細胞移植后不僅存在于重建角膜上皮中,而且也向結膜上移行。角膜修復機制可能是供體細胞主要完成角膜上表皮的重建,并在一段時間內不被受體細胞替代;受體與供體高增殖細胞共同參與角膜上皮的修復,隨著角膜修復進行,受體細胞從角膜緣開始逐漸替代供體細胞,并且角膜上皮的修復與更新是共同發(fā)生的。
[Abstract]:Corneal limbal stem cells ( LSCs ) are the source of corneal epithelium regeneration and repair . Many corneal diseases are caused by the absence of corneal limbal stem cells ( LSCD ) . Many researchers at home and abroad have successfully cured the damaged corneal epithelium by limbal stem cell transplantation ( LSCT ) . 1 . Isolation , Culture and Identification of Goat Cornea Stem Cells The results showed that GLSCs isolated and purified were undifferentiated and had high proliferative capacity and could be used in post - transgenic work . 2 . Establishment of fluorescence protein ( Venus ) cell line of goat corneal limbal stem cells GLSC - V was transfected with pVenus by liposome transfection method , and the optimal concentration of G418 ( 500 渭g / mL ) was used to screen the same physiological characteristics . GLSC - V had the same physiological characteristics as GLSCs . 3 . Construction , transplantation and detection of fluorescent corneal epithelium graft In this study , we observed the expression of P63 , epithelial and central corneal epithelium in the corneal epithelium of the experimental group . The results showed that the reconstructed cornea and the normal corneal epithelium were the same as the normal corneal epithelium . The results showed that the reconstructed cornea and the normal corneal epithelium were not uniform . The results showed that the reconstructed cornea and the normal corneal epithelium were not uniform . The basal and middle layer cells of the normal cornea were only in the presence of small amount of stem cells , but the central corneal epithelium and the middle layer stem cells were reconstructed . The expression of Venus was detected by RT - PCR and immunofluorescence in different regions of corneal epithelium . It is speculated that the corneal epithelium donor cells are not only present in the reconstruction of the corneal epithelium but also to the conjunctiva . The mechanism of corneal repair may be that the donor cells mainly finish the reconstruction of the upper epidermis of the cornea and are not replaced by somatic cells for a period of time ; the receptor and the donor high - proliferative cells are involved in the repair of the corneal epithelium , and the recipient cells gradually replace the donor cells from the corneal margin with the repair of the cornea , and the repair and renewal of the corneal epithelium occur together .

【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R779.6

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本文編號：1538049