本文關(guān)鍵詞： 鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 免疫組織化學(xué) 預(yù)后 活化表型 血管化 血管生成 淋巴管生成 血管生成擬態(tài) 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 金屬基質(zhì)蛋白酶 缺氧誘導(dǎo)因子　出處：《山東大學(xué)》2010年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 研究背景 鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤(sinonasal malignant melanoma, SNM)是耳鼻咽喉一頭頸外科復(fù)發(fā)率較高的惡性腫瘤之一,因為該腫瘤容易血行播散,手術(shù)后復(fù)發(fā)率高,預(yù)后不良,嚴(yán)重威脅人類的健康。盡管較為完整的手術(shù)切除能夠有效延緩腫瘤復(fù)發(fā)時間及延長患者的生存期,但其五年生存率仍低于25%。單純手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步看起來很難再進(jìn)一步改善患者的生存期。鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤的治療是耳鼻喉頭頸外科領(lǐng)域毋庸置疑的挑戰(zhàn)。 腫瘤血管化(tumor vascularization)是腫瘤進(jìn)展的必要前提,抗血管治療成為腫瘤靶向治療的新方向。惡性黑色素瘤(malignant melanoma, MM)的供血模式相對獨(dú)特,由瘤內(nèi)已生成的血管和瘤周的新生血管共同作用。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為腫瘤組織的血液供應(yīng)來自于血管生成(angiogenesis)�？寡苤委煹难芯吭缙谥饕且匝軆�(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell, EC)為靶點。但是近年來,隨著人們對血管化的認(rèn)識越來越深入,抗血管治療的研究重點又轉(zhuǎn)移到以非內(nèi)皮依賴性血管形成的方向上。建立在抗血管生成、抗擬態(tài)生成和抗淋巴管生成基礎(chǔ)之上的多層次、多靶點化的治療方案是未來的抗腫瘤血管治療的最佳策略。 癌癥是一種微環(huán)境和免疫疾病。腫瘤與微環(huán)境相互適應(yīng)、相互作用,甚至相互利用,表現(xiàn)出“亦敵亦友”的關(guān)系,呈現(xiàn)高度的動態(tài)平衡。腫瘤間質(zhì)中的炎性細(xì)胞以及其分泌的細(xì)胞因子是腫瘤的生長、增殖、轉(zhuǎn)移及血管形成的重要來源。巨噬細(xì)胞是一種主要的炎性浸潤成分,是萬能的免疫效應(yīng)細(xì)胞,它既可為免疫系統(tǒng)的正向調(diào)控因素,又可發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。在腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)下,起源于骨髓的單個核細(xì)胞可分化形成獨(dú)特表型的巨噬細(xì)胞一一腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage, TAM)。TAM產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子能促進(jìn)腫瘤的生長、增殖、轉(zhuǎn)移及血管形成,并抑制T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的抗腫瘤活性,對腫瘤的生長和演變有廣泛和復(fù)雜的作用。TAM在鼻腔惡性黑色素瘤中的作用目前也還存在爭議。有觀察認(rèn)為TAM高浸潤是多種腫瘤的不良預(yù)后因素,也有研究者提出TAM是良性指標(biāo)。 巨噬細(xì)胞究竟是發(fā)揮抗腫瘤作用還是促腫瘤作用由其表現(xiàn)的類型決定。微環(huán)境的改變被認(rèn)為是引起巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的主要原因,也被認(rèn)為是影響腫瘤內(nèi)皮依賴和非內(nèi)皮依賴血管化的重要因素,但確切的機(jī)制都尚未探明。腫瘤組織中的微環(huán)境與正常組織的有明顯的差別,缺氧是主要特征之一。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor, HIF)在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子,同時被活化,通過介導(dǎo)缺氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),參與血管生長�；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)是重要的金屬酶之一,可降解W型膠原。體內(nèi)外研究表明,MMP-9在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個階段均有作用,影響腫瘤的生長、血管生成、血管淋巴管浸潤和轉(zhuǎn)移。近期的研究發(fā)現(xiàn),TAM通過旁分泌和自分泌HIF-2／MMPs信號途徑促進(jìn)腫瘤的血管生成,與有淋巴管生(lymphangiogenesis)也有一定的關(guān)系,但其與血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry, VM)等其他血管模式的關(guān)系尚無文獻(xiàn)證實。鼻腔惡性黑色素瘤中TAM浸潤與SNM臨床病理特征和預(yù)后的觀察尚不多見,且腫瘤炎性微環(huán)境與SNM血管化關(guān)系的研究也少見報道。 因此,研究腫瘤炎性微環(huán)境中何種因素對TAM表型轉(zhuǎn)化和血管化產(chǎn)生影響,闡明巨噬細(xì)胞在微環(huán)境中功能變化的分子機(jī)制,以發(fā)揮其積極作用,激活巨噬細(xì)胞的抗腫瘤活性,將可能為未來腫瘤生物治療提供新的線索。本課題擬系統(tǒng)研究SNM不同腫瘤微環(huán)境中的TAM免疫活化狀態(tài),全面觀察SNM的三種血管化模式,探討炎性微環(huán)境與SNM預(yù)后及血管化的關(guān)系。 第一部分：TAM在鼻腔惡性黑色素瘤中的浸潤及臨床意義 目的 從細(xì)胞和基因水平探索鼻腔惡性黑色素瘤病人瘤內(nèi)和瘤周微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分布特點和表型變化,了解SNM患者的巨噬細(xì)胞免疫活化狀態(tài)。同時,探討TAM浸潤與SNM臨床病理特征的關(guān)系和早期SNM患者生存和預(yù)后的影響。 方法 回顧性分析山東大學(xué)齊魯醫(yī)院耳鼻喉科1985年一2008年收治的45例鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤患者患者的臨床病理資料,進(jìn)行隨訪,選取手術(shù)后的鼻腔惡性黑色素瘤組織標(biāo)本。應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)測定SNM瘤內(nèi)和瘤周組織CD68標(biāo)記的TAM的表達(dá)。并進(jìn)行比較,了解兩組間有無差異。探討TAM浸潤與SNM臨床病理特征的關(guān)系以及TAM浸潤對早期SNM患者生存和預(yù)后的影響。macrophage可以分為M1和M2兩個亞類,應(yīng)用免疫熒光雙染標(biāo)記M1的特異性標(biāo)記物iNOS (Inducible nitric oxide synthase,誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶)和M2的特異性標(biāo)記物CD206,明確M1,M2在瘤周和瘤內(nèi)的分布特點和表型變化,以便了解SNM患者巨噬細(xì)胞的免疫活化狀態(tài)。 結(jié)果 1.各組病例的臨床資料(略) 2.免疫組化染色成功的45例SNM瘤內(nèi)和瘤周組織中均能見到TAM浸潤。SNM瘤內(nèi)TAM平均計數(shù)為13.3±7.3macrophages/0.155mm2,明顯低于瘤周的TAM平均計數(shù)20.1±10.0macrophages/0.155mm2,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)。即在瘤內(nèi)組織中的TAM浸潤更密集。用聚類分析法可將TAM計數(shù)聚為低密度和高密度組類,經(jīng)檢驗得出CD68在SNM瘤內(nèi)和癌周組織中的表達(dá)存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),這與TAM計數(shù)方差分析結(jié)果一致。 3.對SNM組病例的各種臨床病理特征與TAM浸潤的關(guān)系進(jìn)行單因素分析,發(fā)現(xiàn)TAM浸潤與臨床分期、腫瘤Breslow浸潤厚度和腫瘤侵襲性有關(guān)。高侵襲性的SNM中,TAM浸潤與血管生成擬態(tài)相關(guān)。 4.瘤內(nèi)微環(huán)境中,45例病人SNM組織中TAM均同時表達(dá)CD68和CD206,CD206陽性巨噬細(xì)胞占全部TAM的69%-85%；有5例SNM患者TAM同時表達(dá)CD68和iNOS,占全部TAM的11.1%。癌周微環(huán)境中,37例(82.2%)SNM患者同時表達(dá)CD68和iNOs,8例(17.8%)僅表達(dá)CD68；未見有同時表達(dá)CD68和CD206的病例。表明不同腫瘤微環(huán)境對巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的具有影響：在瘤內(nèi)微環(huán)境中巨噬M2型轉(zhuǎn)化,而在瘤周微環(huán)境中巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化。 5.選取SNM早期(Ⅰ／Ⅱ期)患者共33例,以TAM浸潤密度的中位數(shù)為界,將其分為TAM低密度組與TAM高密度組。Log-Rank檢驗分析發(fā)現(xiàn)瘤內(nèi)微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的密度與早期SNM患者的平均總生存期相關(guān)(P=0.036),瘤內(nèi)TAM低密度組患者的生存期(median,57 months)明顯高于瘤內(nèi)TAM高密度組患者(median,13 months)。而瘤周微環(huán)境中TAM密度對早期SNM患者的平均總生存期無意義(P=0.408)。表明瘤內(nèi)TAM浸潤密度是影響早期SNM患者生存的獨(dú)立的預(yù)后因子。 結(jié)論 1.鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤組織中TAM明顯浸潤,瘤周組織中TAM的浸潤密度比瘤內(nèi)高。 2.鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤組織中TAM浸潤密度與與臨床分期、腫瘤Breslow浸潤厚度和腫瘤侵襲性有關(guān)。在高侵襲性的SNM中,TAM浸潤與血管生成擬態(tài)相關(guān)。 3.腫瘤微環(huán)境對巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的具有影響：在瘤內(nèi)微環(huán)境中巨噬M2型轉(zhuǎn)化,而在瘤周微環(huán)境中巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化。 4.瘤內(nèi)TAM浸潤密度是早期SNM患者的獨(dú)立預(yù)后因子。 第二部分：腫瘤微環(huán)境對鼻腔惡性黑色素瘤血管化的影響及其機(jī)制探討 目的 觀察鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤的三種最關(guān)鍵的血管化模式(血管生成、淋巴管生成和血管生成擬態(tài))。從細(xì)胞和基因水平聯(lián)合測定SNM瘤內(nèi)和瘤周TAM浸潤、MMP-9及HIF-2α的表達(dá),并探討TAM-MMP-9／HIF-2α與SNM血管化的關(guān)系,初步闡明腫瘤炎性微環(huán)境對SNM血管化的影響和信號機(jī)制。 方法 回顧性分析山東大學(xué)齊魯醫(yī)院耳鼻喉科1985年一2008年收治的45例鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤患者患者的臨床病理資料,進(jìn)行隨訪,選取手術(shù)后的鼻腔惡性黑色素瘤組織標(biāo)本。定量觀察SNM瘤內(nèi)和瘤周組織三種主要的血管化模式：包括CD34標(biāo)記的微血管生成密度,D2-40標(biāo)記的淋巴管計數(shù)和PAS／CD34雙標(biāo)的血管生成擬態(tài)。從細(xì)胞和基因水平聯(lián)合測CD68、MMP-9及HIF-2α的表達(dá)。探討TAM-MMP-9／HIF-2α與SNM血管化的相關(guān)性 結(jié)果 1.SNM瘤內(nèi)組織標(biāo)本中觀察到了內(nèi)皮依賴性血管、內(nèi)皮依賴性淋巴管和血管生成擬態(tài)三種血液供應(yīng)模式。瘤周組織只見內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管和內(nèi)皮細(xì)胞依賴性淋巴管兩種血液供應(yīng)模式,未見血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)。 2.CD34標(biāo)記的MVD在SNM瘤內(nèi)組織和瘤周組織分別為17.7±2.3和23.2±7.3,兩組的數(shù)值存在統(tǒng)計學(xué)差異,P0.05。在45例鼻腔惡性黑色素瘤組織中有11例(24.4%)存在血管生成擬態(tài)。D2-40標(biāo)記的LVD在SNM瘤內(nèi)組織和瘤周組織分別為2.1±3.7和1.7±6.3,數(shù)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。 3.CD68、MMP-9和HIF-2α三者在鼻腔惡性黑色素瘤中的表達(dá)部位有相似性。45例SNM中MMP-9總陽性率為75.6%(34／45),HIF-2α總陽性率為40%(18／45)。應(yīng)用免疫組化圖象分析軟件對SNM瘤內(nèi)和瘤周區(qū)域的MMP-9和HIF-2α進(jìn)行半定量比較,發(fā)現(xiàn)SNM瘤內(nèi)MMP-9和HIF-2α陽性顆粒的強(qiáng)度均值、陽性面積及強(qiáng)度均值×陽性面積均比瘤周區(qū)域明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。 4.瘤內(nèi)微環(huán)境中TAM計數(shù)與MVD、VM和LVD密度無顯著相關(guān)；但是HIF-2α陽性的IT-TAM計數(shù)與MVD呈顯著相關(guān)(r=0.871,P=0.01),與VM成輕度正相關(guān),但未見相關(guān)的顯著性(r=0.464,P=-0.056)。瘤周微環(huán)境中TAM計數(shù)與MVD和LVD密度無顯著相關(guān)。 5.瘤內(nèi)微環(huán)境中HIF-2α與瘤內(nèi)MVD呈正相關(guān)(r=0.558,P=0.039),與瘤內(nèi)VM和LVD無顯著相關(guān)。瘤周MVD和LVD與HIF-2α蛋白表達(dá)水平無顯著相關(guān)。 6.瘤內(nèi)微環(huán)境中MMP-9和MVD密度正相關(guān)(r=0.513,P=0.049)；與瘤內(nèi)VM和LVD無顯著相關(guān)。瘤周微環(huán)境中MMP-9蛋白與LVD顯著相關(guān)(r=0.671,P=0.014)。MMP-9的表達(dá)與CD68的表達(dá)呈正相關(guān),P=0.022。 結(jié)論 1.微血管在SNM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；但微淋巴管SNM的發(fā)生發(fā)展中作用不能確定。 2.TAM的浸潤可能尚不足以引起SNM血管和淋巴管的生成,但TAM可以通過上調(diào)HIF-2α的表達(dá),促進(jìn)微血管和血管生成擬態(tài)生成。 3.MMP-9和TAM在鼻腔鼻竇惡性黑色素瘤血管化過程中有協(xié)同作用。MMP-9參與SNM瘤內(nèi)及瘤周組織的微血管生成,也影響瘤周淋巴管的生成,是影響SNM血管化的重要因素。 4.腫瘤炎性微環(huán)境通過TAM-MMP9／HIF-2α通路對SNM血管化產(chǎn)生重要影響,該結(jié)果揭示了抑制腫瘤炎性微環(huán)境是控制腫瘤血管生成和生長的新靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1516175