發(fā)布時間：2018-02-15 00:41

  本文關(guān)鍵詞： 水通道蛋白-4 膠質(zhì)細胞 急性高眼壓 內(nèi)涵體 溶酶體 內(nèi)化 降解 靜水壓　出處：《重慶醫(yī)科大學》2013年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：水通道蛋白-4（aquaporin-4，AQP4）是腦和視網(wǎng)膜中最主要的一種水通道蛋白。在視網(wǎng)膜中，AQP4位于膠質(zhì)細胞（包括星形膠質(zhì)細胞及Müller細胞）的特殊膜域，使水沿著靜水壓和滲透壓的梯度從高向低流動。國內(nèi)外的研究資料表明，AQP4不僅與正常視網(wǎng)膜中水、電解質(zhì)、滲透壓平衡的維持和眼內(nèi)壓的調(diào)節(jié)有關(guān)，而且與疾病狀態(tài)下視網(wǎng)膜水腫時水的異常轉(zhuǎn)運有關(guān)；在高眼壓/再灌注損傷大鼠模型中,不僅視網(wǎng)膜內(nèi)AQP4的表達量可出現(xiàn)異常，而且其在視網(wǎng)膜中的定位也可發(fā)生改變。上述結(jié)果提示，高眼壓/再灌注損傷可導致AQP4的定量及定位的異常，但是引起這些異常的機制仍不清楚。 有資料顯示，包括AQP4在內(nèi)的部分膜蛋白可發(fā)生內(nèi)化（internalization）－即其亞細胞定位發(fā)生改變，并同時伴隨其功能的變化，而且內(nèi)化入胞的蛋白質(zhì)也可分選（sorting）至溶酶體，在此過程中他們被水解酶完全降解；目前，關(guān)于高眼壓及再灌注損傷所致AQP4的改變是否與其內(nèi)化及溶酶體內(nèi)降解有關(guān)，尚未見報道。 因此，本課題從在體及離體兩方面展開研究，通過大鼠模型研究急性高眼壓(acute ocular hypertension, AOH)及再灌注損傷條件下AQP4內(nèi)化/溶酶體分選的規(guī)律，并通過離體實驗研究AQP4內(nèi)化/溶酶體降解的機制。本研究結(jié)果將闡明高眼壓視網(wǎng)膜損傷的分子機制，并可為視網(wǎng)膜水腫防治的新藥開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。 研究目的 1.研究急性高眼壓/再灌注損傷模型介導大鼠視網(wǎng)膜AQP4內(nèi)化/溶酶體分選的發(fā)生及其時空變化規(guī)律，并探討其與視網(wǎng)膜水腫發(fā)生之間的關(guān)系。 2.通過加壓細胞培養(yǎng)，研究壓力因素對AQP4內(nèi)化/溶酶體降解的影響，對高眼壓條件下視網(wǎng)膜AQP4內(nèi)化/溶酶體分選的機制進行初步探討。 研究內(nèi)容和方法 1.成年健康雌性SD（Sprague Dawley）大鼠180只，隨機分為高眼壓組與再灌注組用于造模。大鼠麻醉后固定于立體定位儀上，采用左眼前房灌注加壓法制作110mm Hg急性高眼壓大鼠模型；高眼壓組根據(jù)高眼壓維持時間分為高眼壓5、10、30、60、90min等5組；再灌注組在維持高眼壓狀態(tài)60min后，根據(jù)再灌時間分為再灌注0、1、2、4、8、12h等組；每組大鼠的右眼平均分為兩部分，一半作為正常對照組，另一半作為假手術(shù)組，只穿刺，不加壓，以排除操作過程對實驗結(jié)果的影響。造模結(jié)束后，每組選取6只大鼠，剝離視網(wǎng)膜后采用干-濕重法檢測各組視網(wǎng)膜組織含水量的變化；剩余的大鼠經(jīng)過灌流固定后，，進行視網(wǎng)膜切片及鋪片，使用HE染色觀察各組視網(wǎng)膜（切片）病理改變；應用免疫熒光雙標方法鑒定視網(wǎng)膜（切片）中AQP4陽性細胞的種類、檢測各組大鼠視網(wǎng)膜（切片/鋪片）中AQP4與早期內(nèi)涵體標記物EEA1、晚期內(nèi)涵體標記物甘露糖-6-磷酸受體（MPR）及溶酶體相關(guān)膜蛋白-1（LAMP1）的共表達，計數(shù)各組視網(wǎng)膜中AQP4陽性細胞及AQP4/EEA1、AQP4/LAMP1共表達細胞的數(shù)量，并計算及比較其比例。 2.體外培養(yǎng)大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞（加入層粘連蛋白,即laminin蛋白）及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AQP4的CHO細胞，使用免疫熒光染色方法檢測兩種細胞AQP4的表達；將每種細胞隨機分為對照組、加壓組。對照組不做任何處理，加壓組在0.02MPa壓力條件下培養(yǎng)3h,應用免疫熒光雙標方法檢測各組細胞AQP4/EEA1、AQP4/MPR及AQP4/LAMP1的共表達；使用鈣黃綠素淬滅法（Calcein-quenching method）檢測各組細胞水通透性的改變。 結(jié)果 1.高眼壓10min后，各實驗組大鼠視網(wǎng)膜含水量均較對照組增加(P＜0.05)，再灌注1h組視網(wǎng)膜含水量達到峰值92.76%，再灌注2h至4h短暫下降至86.33%(P＜0.05)，其后繼續(xù)上升；HE染色結(jié)果顯示實驗組視網(wǎng)膜層次結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，呈水腫表現(xiàn)；免疫熒光雙標記結(jié)果顯示在正常視網(wǎng)膜中，AQP4+/GFAP+的星形膠質(zhì)細胞位于神經(jīng)纖維層和節(jié)細胞層，AQP4+/GS+（Glutamine synthetase）的Müller細胞胞體位于內(nèi)核層。在高眼壓5、10、30、60及90min組及再灌注0-12h大鼠視網(wǎng)膜GCL（及INL）內(nèi)，均可見AQP4/EEA1的共表達，并且AQP4/EEA1共表達細胞在高眼壓60min達峰值(72.97%±9.89%, P＜0.05)；在高眼壓90min及再灌注12h未見AQP4／MPR的共表達，其它時間點均觀察到AQP4／MPR的共表達；在高眼壓后再灌注1、2、4、8、12h，可見到AQP4／LAMP1的共表達，再灌注4h，膠質(zhì)細胞中AQP4/LAMP1共表達細胞的比例達到最大值（55.60%±13.03%，與相鄰上一時間點相比，P＜0.05），此后共表達細胞比例逐漸減少。 2.原代培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞，在20nM的層粘連蛋白（laminin蛋白）孵育條件下，其AQP4呈簇狀表達于細胞膜上；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AQP4的CHO (Chinese hamster ovary,中國倉鼠卵巢癌)細胞，其AQP4呈線形均勻分布于細胞膜上；加壓處理的膠質(zhì)細胞及CHO細胞，可見胞膜上部分AQP4轉(zhuǎn)移入胞質(zhì)內(nèi)，并與EEA1、MPR及LAMP1存在著共表達；與對照組相比,加壓后的膠質(zhì)細胞及CHO細胞水通透性分別下降49.02%及58.81%(P＜0.05)。 結(jié)論 1.急性高眼壓及再灌注損傷可導致視網(wǎng)膜發(fā)生水腫，在該過程中視網(wǎng)膜膠質(zhì)細胞所表達的AQP4內(nèi)化進入早期內(nèi)涵體及晚期內(nèi)涵體，部分內(nèi)化的AQP4可分選至溶酶體內(nèi)降解。AQP4的內(nèi)化／降解可能在視網(wǎng)膜水腫的發(fā)生、發(fā)展中起著作用，并可作為發(fā)展視網(wǎng)膜水腫治療藥物的靶點。 2.壓力因素可導致視網(wǎng)膜Müller細胞及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染AQP4的CHO細胞膜上的AQP4內(nèi)化進入早期內(nèi)涵體及晚期內(nèi)涵體，并且內(nèi)化的AQP4可分選至溶酶體降解。AQP4的內(nèi)化／降解導致細胞對水的通透能力下降，可能是細胞針對壓力所致?lián)p傷的適應性反應。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R775

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本文編號：1512017