本文關鍵詞： 視網膜神經節(jié)細胞 壓力 凋亡 OPTN基因 青光眼　出處：《中國醫(yī)科大學》2010年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 青光眼是世界第二大致盲性眼病,視網膜神經節(jié)細胞(Retinal ganglion cells, RGCs)的凋亡是青光眼發(fā)病的基本病理機制,眼內壓升高是最重要的危險因素,但是眼內壓引起RGCs凋亡的確切機制還不清楚。有研究表明遺傳因素在青光眼的發(fā)病中起著重要的作用。OPTN基因是POAG確定的兩個致病基因之一,研究證實其在細胞存活和凋亡中起到調控作用。本實驗對RGC-5 (Retinal ganglion cell-5)進行加壓培養(yǎng),通過對不同壓力培養(yǎng)條件下視網膜神經節(jié)細胞的生長存活率、凋亡情況及OPTN基因表達等指標的觀察,分析不同壓力培養(yǎng)條件下RGC-5細胞的活性和總體存活狀態(tài),從而初步探討壓力對視網膜神經節(jié)細胞的直接作用及影響。 方法 對傳代培養(yǎng)的RGC-5分別給予0、20、40、60、80mmHg壓力48小時,應用MTT方法和流式細胞學檢測方法檢測壓力對RGC-5細胞存活率和凋亡的影響。應用免疫組織化學方法、Q-Real-time PCR和Western-Blot的方法檢測壓力作用下培養(yǎng)的RGC-5細胞OPTN基因的表達量。統(tǒng)計結果均以均數±標準差表示,各組間的比較用配對t檢驗分析方法,均用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。 結果 1、培養(yǎng)的RGC-5細胞呈梭型,平均分裂時間為2-3天左右,細胞生長旺盛。 2、MTT和流式檢測結果顯示在加壓處理48小時后RGC-5存活率隨著壓力的增高逐漸下降,各組間差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.01)；RGC-5細胞凋亡率不斷增高,在40mmHg時以早期凋亡為主,60mmHg時以晚期凋亡為主,在80mmHg時細胞以死亡為主。 3、免疫組織化學檢測結果顯示各加壓組平均積分光密度(Integrated optical density average,IODA)值為20mmHg組：(5.32±0.42)；40mmHg組：(3.1±0.85)；60mmHg組：(5.8±1.13)：80mmHg組：(8.9±1.26)；對照組：(10.58±1.45)。各加壓組IODA值與對照組比較,均有統(tǒng)計學差異(P0.05)；采用Q-Realtime-PCR定量分析,Gapdh作為內參,得出在20、40、60、80mmHg壓力作用下RGC-5細胞內OPTN基因mRNA的表達量分別為對照組的0.12倍,0.04倍,0.35倍,0.48倍,各加壓組細胞mRNA表達量與對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P0.05)；采用Western blot方法分析,Gapdh作為內參,得出在20、40、60、80mmHg壓力作用下RGC-5細胞Optineurin蛋白表達量分別為對照組的0.91倍,0.79倍,0.86倍,0.96倍,20mmHg和80mmHg加壓組與對照組比較無統(tǒng)計學差異(P0.05),40mmHg和60mmHg加壓組與對照組比較有顯著的統(tǒng)計學差異(P0.01) 結論 1、壓力直接影響培養(yǎng)RGC-5的存活狀態(tài)； 2、隨絕對壓力的不斷增高,培養(yǎng)RGC-5細胞存活率不斷降低,細胞凋亡和死亡趨見明顯。 3、隨絕對壓力的不斷增高,RGC-5細胞OPTN基因表達水平的V字形波動提示在不同壓力條件下OPTN基因對培養(yǎng)視網膜神經節(jié)細胞的存活的調控作用可能不同,存在著細胞受損晚期的保護性作用可能。
[Abstract]:Glaucoma is the world second big blind eye disease, retinal ganglion cells (Retinal ganglion cells, RGCs) apoptosis is the basic pathogenesis of glaucoma, increased intraocular pressure is the most important risk factor, but the exact mechanism of RGCs intraocular pressure caused by apoptosis is unclear. Studies have shown that plays in the pathogenesis of genetic factors in glaucoma the important role of.OPTN gene is one of the two genes identified by POAG, proved that it plays a regulatory role in cell survival and apoptosis. The experiments of RGC-5 (Retinal ganglion cell-5) the pressure training, according to the different pressure conditions of retinal ganglion cells survival rate, apoptosis and expression of OPTN gene other indicators, analysis of the cultured RGC-5 cell activity and survival status of the different pressure, so as to investigate the pressure on retinal ganglion cells The direct effect and influence of the cell.
Method
The cultured RGC-5 were given 0,20,40,60,80mmHg pressure for 48 hours, and affect the rate of apoptosis and flow cytometry using MTT method detection method of pressure on the survival of RGC-5 cells. Immunohistochemical method, Q-Real-time PCR method and Western-Blot detection for pressure expression of RGC-5 OPTN gene in cultured cells. The statistical results are the mean and standard deviation, paired t test analysis method comparison between two groups, were analyzed by using SPSS13.0 software.
Result
1, the cultured RGC-5 cells were spindle shaped, with an average split time of about 2-3 days, and the cells grew exuberant.
2, MTT and flow cytometry showed in the pressure after 48 hours of treatment RGC-5 survival rate decreased gradually with the increasing pressure, and there were significant differences between the groups (P0.01); the apoptosis rate of RGC-5 cells increased, mainly at the early stage of apoptosis of 40mmHg, 60mmHg in late apoptosis in 80mmHg cells by. Death.
3. Immunohistochemical detection results showed that the compression group average integral optical density (Integrated optical density average, IODA) = 20mmHg group: (5.32 + 0.42); group 40mmHg (3.1 + 0.85); group 60mmHg (5.8 + 1.13):80mmHg group: (8.9 + 1.26); control group: (10.58 + 1.45). The IODA value of compression group compared with the control group, were statistically significant (P0.05); the quantitative analysis of Q-Realtime-PCR, Gapdh as reference, the expression of RGC-5 OPTN gene in mRNA cells under pressure of 20,40,60,80mmHg was 0.12 times, 0.04 times that of the control group, 0.35 times, 0.48 times each. The expression of mRNA in cell compression group and control group were statistically significant (P0.05); Western analysis by using blot method, Gapdh as reference, obtained under pressure of 20,40,60,80mmHg RGC-5 cells Optineurin protein expression were 0.91 times, 0.79 times that of the control group, 0.86 times 0.96 times, there was no significant difference between the 20mmHg and 80mmHg compression group and the control group (P0.05). There was a significant difference between the 40mmHg and 60mmHg compression group and the control group (P0.01).
conclusion
1, the pressure directly affected the survival of RGC-5.
2, with the increase of absolute pressure, the survival rate of RGC-5 cells was decreased, and apoptosis and death were obvious.
3, with the increase of absolute pressure, the V shape fluctuation of OPTN gene expression level in RGC-5 cells suggests that the regulation of OPTN gene on the survival of cultured retinal ganglion cells may be different under different pressure conditions, and there may be a protective effect of late stage of cell damage.

【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R775.9

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本文編號：1490772