發(fā)布時(shí)間：2018-01-26 07:42

  本文關(guān)鍵詞： 視神經(jīng)損傷 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 Nogo-A受體 Caspase-3　出處：《新疆醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 視神經(jīng)損傷是顱腦、面部和眼眶外傷嚴(yán)重的并發(fā)癥,受傷后視力損害嚴(yán)重,經(jīng)常遺留永久性視力障礙。長(zhǎng)期以來,關(guān)于視神經(jīng)損傷的治療一直存在著爭(zhēng)議。現(xiàn)有研究認(rèn)為,使用糖皮質(zhì)激素為主的藥物治療法和手術(shù)治療法是最常用的治療手段,視神經(jīng)管減壓術(shù)已成為目前主要的手術(shù)治療方法,視神經(jīng)減壓術(shù)是解除直接壓迫,緩解神經(jīng)腫脹及血管痙攣,對(duì)于視神經(jīng)損傷有一定的療效；地塞米松對(duì)于視神經(jīng)損傷有著皮質(zhì)激素可通過其抗氧化作用減輕自由基對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷而使水腫減輕,同時(shí)阻斷外傷性炎癥介質(zhì)及血管活性物質(zhì)的產(chǎn)生,從而減輕血管痙攣,降低視神經(jīng)挫傷性壞死的嚴(yán)重性以及微循環(huán)血管痙攣程度的作用。以往實(shí)驗(yàn)偏向于動(dòng)物模型制作,對(duì)臨床指導(dǎo)作用缺乏。本實(shí)驗(yàn)以視神經(jīng)減壓術(shù)、地塞米松藥物治療及視神經(jīng)減壓術(shù)聯(lián)合地塞米松藥物治療為影響因素,以視神經(jīng)Nogo受體,視網(wǎng)膜Nogo受體、Caspase-3為切入點(diǎn),對(duì)兔視神經(jīng)損傷模型的視網(wǎng)膜及視神經(jīng)受體進(jìn)行光鏡及電鏡下病理生理觀察。初步明確視神經(jīng)減壓術(shù)、地塞米松藥物治療及視神經(jīng)減壓術(shù)聯(lián)合地塞米松藥物治療對(duì)于視神經(jīng)模型的影響。為臨床視神經(jīng)治療提供理論基礎(chǔ)。通過假傷組與對(duì)照組驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理性。通過臨時(shí)動(dòng)脈瘤夾閉視神經(jīng)制造可用于視神經(jīng)損傷手術(shù)或藥物治療的觀察研究穩(wěn)定的的動(dòng)物模型。 方法： (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組： 成年健康白兔96只,種屬為新西蘭白兔,體重2-2.5kg,由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后檢查雙側(cè)眼,發(fā)現(xiàn)屈光間質(zhì)清,瞳孔等大、等圓,對(duì)光反射靈敏,眼底無(wú)異常;其中6只為空白對(duì)照組,18只為假傷組,以排除手術(shù)因素對(duì)視神經(jīng)及視網(wǎng)膜的影響,對(duì)剩余72只白兔左眼進(jìn)行視神經(jīng)損傷模型制作,隨機(jī)分為模型組、單純視神經(jīng)損傷組,地塞米松藥物治療影響組、視神經(jīng)減壓術(shù)影響組、視神經(jīng)減壓術(shù)聯(lián)合地塞米松藥物治療共同影響組四個(gè)大組,每個(gè)大組分為三個(gè)亞組,分別為術(shù)后1天組、7天組、21天組,每個(gè)亞組6只。 (2)動(dòng)物模型的制作 3%戊巴比妥1ml/kg耳緣靜脈注射麻醉白兔后,俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)；在雙目顯微鏡下,上瞼外側(cè)置一牽引縫線,固定以牽開上瞼；剪開球結(jié)膜,在上直肌及上斜肌肌止端處作牽引縫線；將眼球向眶前外下方向拉,顯微鏡下銳性分離球后軟組織,以暴露視神經(jīng),向深部分離視神經(jīng)約8mm,于球后3mm處用動(dòng)脈瘤夾(蛇牌臨時(shí)動(dòng)脈瘤夾FT250T,咬合長(zhǎng)度9mm,最大開口7mm,閉合力0.88N,重量：9克。)夾閉20s(假傷組不夾閉視神經(jīng))。將眼球復(fù)位、縫合球結(jié)膜。生理鹽水沖洗眼眶,滴加左氧氟沙星滴眼液。動(dòng)物模型建立標(biāo)準(zhǔn)：視神經(jīng)損傷動(dòng)物模型建立術(shù)后,待蘇醒后放回籠內(nèi),檢查手術(shù)切口愈合良好,無(wú)化膿積膿,無(wú)滲血滲液,觀察傷眼瞳孔散大,直接對(duì)光反應(yīng)消失,術(shù)眼角膜透明、無(wú)外傷性白內(nèi)障發(fā)生、玻璃體腔無(wú)積血、視網(wǎng)膜血液供應(yīng)正常無(wú)出血和視網(wǎng)膜脫離發(fā)生、術(shù)眼玻璃體無(wú)炎性反應(yīng)、視網(wǎng)膜血管無(wú)出血及梗塞,無(wú)眼球突出及眼瞼閉合,不全者納入實(shí)驗(yàn)。經(jīng)以上各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)檢測(cè)反映該模型建立成功與否。經(jīng)上述標(biāo)準(zhǔn)檢查,96只新西蘭白兔的視神經(jīng)動(dòng)物模型隨機(jī)分批納入實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物飼養(yǎng)過程中,對(duì)于出現(xiàn)并發(fā)癥者排出實(shí)驗(yàn),并及時(shí)補(bǔ)足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)目。 (3)視神經(jīng)減壓術(shù) 按照實(shí)驗(yàn)分組,對(duì)于需要實(shí)行視神經(jīng)減壓術(shù)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,按上述模型制作方法制作模型,動(dòng)脈瘤夾夾閉20s后,采用1ml注射器針頭顯微鏡下分離視神經(jīng)外包膜組織至球后視神經(jīng)8mm處,達(dá)到視神經(jīng)減壓目的。 (4)地塞米松給藥方法 所有地塞米松影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,于術(shù)后當(dāng)日開始,按每日每只1mg/kg劑量,進(jìn)行肌肉注射,直至達(dá)到各處死節(jié)點(diǎn)。 (5)視神經(jīng)及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層標(biāo)本采集及其形態(tài)學(xué)研究： 采用3%戊巴比妥鈉麻醉過量麻醉,開胸經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈,上腔靜脈開口排出灌注液,依次灌注生理鹽水500ml,2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液250ml,至兔子出現(xiàn)四肢抽搐強(qiáng)直后,立即摘除眼球取視神經(jīng)視網(wǎng)膜標(biāo)本置于固定液中,并標(biāo)記,光鏡標(biāo)本用4%多聚甲醛固定72h、脫水、石蠟包埋,通過視神經(jīng)乳頭,沿眼球的垂直經(jīng)線行前后方向視網(wǎng)膜全層進(jìn)行切片,行HE染色。使用切片機(jī)制備切片。RGC計(jì)數(shù)方法：用光學(xué)顯微鏡(40物鏡)觀察,每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)抽取3張切片,距離視神經(jīng)乳頭上方和下方300um分別3個(gè)區(qū)域(每個(gè)區(qū)域25um*25um),統(tǒng)計(jì)存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目的總和。計(jì)算視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)總和然后取平均數(shù)并記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),最后利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析各組不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)存活的細(xì)胞數(shù),其凋亡規(guī)律以及各組是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 電鏡標(biāo)本：將視神經(jīng)標(biāo)本用4%戊二醛電鏡固定液固定。冰箱恒溫保存,于電鏡室4%戊二醛和1%四氧化鋨雙重固定,丙酮梯度脫水,Epon812環(huán)氧樹脂包埋,LKB2188超薄切片機(jī)切片,鉛鈾電子染色,JEOL1230透射電子顯微鏡觀察。 (6)觀測(cè)指標(biāo)及時(shí)間點(diǎn) 觀察指標(biāo)：夾閉后1天、一周、3周觀察：1)夾閉后局部視網(wǎng)膜及視神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)光鏡觀察,及視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察；2)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cell, RGC)計(jì)數(shù)(細(xì)胞原位凋亡技術(shù)檢測(cè))；3)視網(wǎng)膜上Caspase-3的免疫組化檢測(cè)；4)視神經(jīng)、視網(wǎng)膜Nogo受體的免疫組化檢測(cè),病理免疫組化結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析視神經(jīng)減壓術(shù)及地塞米松對(duì)于視神經(jīng)模型的影響。 (7)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)資料為多組定量資料,若分組或時(shí)間符合正態(tài)、方差齊性,進(jìn)行方差分析,若不符合,使用Kruskal-wallis (KW)秩和檢驗(yàn)。同時(shí)進(jìn)行不同分組及不同時(shí)間的兩兩比較各組數(shù)據(jù)用sas jmp pro計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表中*為不符合方差齊性,使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果： (1)組織形態(tài)學(xué)光鏡觀察,采用HE染色法視神經(jīng)損傷后,光鏡下觀察,早期視網(wǎng)膜出現(xiàn)腫脹,各層厚度較正常略增厚,細(xì)胞排列疏松而紊亂,僅見視網(wǎng)膜毛細(xì)血管擴(kuò)張,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞少量減少。 視網(wǎng)膜HE染色組織形態(tài)學(xué)觀察對(duì)照組視網(wǎng)膜層次清晰,R G C呈單層排列,整齊密集,胞核清楚,核膜光滑完整,各時(shí)間點(diǎn)損傷病理改變明顯,病變隨時(shí)間推移進(jìn)行性加重。損傷一天組視網(wǎng)膜形態(tài)改變,細(xì)胞輕度水腫,厚度稍變厚,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層內(nèi)外層排列稍紊亂,細(xì)胞間隙增大,有少量核固縮,染色加深,大量節(jié)細(xì)胞空泡變性,細(xì)胞數(shù)量稍微減少。損傷一周組視網(wǎng)膜形態(tài)改變,較前一組加重,細(xì)胞水腫嚴(yán)重,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核染色質(zhì)深染加重,可見大量空泡變性的細(xì)胞,外層和內(nèi)層結(jié)構(gòu)紊亂,界限模糊不清,視網(wǎng)膜全層明顯變薄。損傷三周組,視網(wǎng)膜細(xì)胞水腫改變較之前有所減輕,核質(zhì)染色深染,各層結(jié)構(gòu)紊亂,視網(wǎng)膜全層變薄。 (2)視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察1天(圖3-1)神經(jīng)纖維輕微變形,髓鞘板層結(jié)構(gòu)輕度分離,局部可見泡狀結(jié)構(gòu),可見球狀突向軸漿,髓鞘板層結(jié)構(gòu)分離,軸漿神經(jīng)原纖維排列松散,以粗纖維為主,血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,管腔不全阻塞,神經(jīng)纖維破碎,髓鞘塌陷等急性創(chuàng)傷改變排列不齊少量線粒體輕微腫脹。7天(圖3-2)髓鞘松解,髓鞘普遍變性,洋蔥樣小體形成,膠質(zhì)明顯增生,仍殘留有水腫軟化小區(qū)厚度增加,板層結(jié)構(gòu)分離層多層,個(gè)別表現(xiàn)為脫髓鞘。膠質(zhì)細(xì)胞輕微腫脹,線粒體空泡變,部分神經(jīng)軸漿空泡變。21天(圖3-3)神經(jīng)變性,神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)不規(guī)則,髓鞘結(jié)構(gòu)紊亂明顯,可見鞘膜泡狀解離,部分纖維軸漿空泡變,水腫軟化灶消失,由膠質(zhì)代替.各治療組無(wú)明顯差別。 (3)視神經(jīng)細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞在急性視神經(jīng)損傷模型建立后視神經(jīng)減壓術(shù)治療在(1d)有差異(P0.05),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。地塞米松、視神經(jīng)管減壓術(shù),兩者有差異(P0.05)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。視神經(jīng)減壓術(shù)、地塞米松及減壓地塞米松三種治療組與單純損傷組在7天、21天個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)差異(P0.05),且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (4)視網(wǎng)膜上Caspase-3的免疫組化的檢測(cè) 視神經(jīng)減壓術(shù)、地塞米松及減壓地塞米松三種治療與單純損傷組在1天時(shí)間點(diǎn)有差異(P0.05),且具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與單純損傷組在7天、21天個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)差異(P0.05),且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 (5)視神經(jīng)視網(wǎng)膜Nogo受體的免疫組化檢測(cè) Nogo-A在正常成年大鼠視神經(jīng)和視網(wǎng)膜中廣泛分布。急性視神經(jīng)損傷可以促使Nogo-A表達(dá)上調(diào)。視神經(jīng)減壓術(shù)、地塞米松及減壓地塞米松三種治療與單純損傷組在1天時(shí)間點(diǎn)有差異(P0.05),且具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與單純損傷組在7天、21天個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)差異(P0.05),且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： (1)本研究通過臨時(shí)動(dòng)脈瘤夾閉視神經(jīng),可制造穩(wěn)定的、可重復(fù),易操作的用于視神經(jīng)損傷手術(shù)或藥物治療觀察研究的動(dòng)物模型,通過假傷組視神經(jīng)及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及特殊分子生物學(xué)表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,假傷組與對(duì)照組驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理,可較好的運(yùn)用視神經(jīng)損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模；據(jù)細(xì)胞數(shù)目變化時(shí)間點(diǎn)得出視神經(jīng)細(xì)胞凋亡時(shí)間可能遲于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡時(shí)間。 (2)本研究結(jié)果顯示：急性視神經(jīng)損傷后RGC凋亡是一個(gè)隨時(shí)間進(jìn)行而發(fā)生的持續(xù)細(xì)胞凋亡過程。本實(shí)驗(yàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)表中單純減壓組細(xì)胞數(shù)低于單純夾閉組,可能因視神經(jīng)為大腦中樞神經(jīng)的延續(xù),與周圍神經(jīng)有本質(zhì)的區(qū)別,神經(jīng)鞘膜切開可能對(duì)視神經(jīng)造成新的損傷；提示對(duì)于臨床上外傷患者及時(shí)減壓神經(jīng)鞘外(骨性管、血腫)壓迫結(jié)構(gòu),可能是較好的治療手段。是否能通過測(cè)定不同程度損傷后視神經(jīng)鞘內(nèi)組織壓,觀察病理微環(huán)境改變來證實(shí)此假說。 (3)急性視神經(jīng)損傷可以促使Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)上調(diào),表明Caspase-3可能在視神經(jīng)損傷的神經(jīng)再生過程中發(fā)揮著重要作用。Nogo-A在正常成年大鼠視神經(jīng)和視網(wǎng)膜中廣泛分布,急性視神經(jīng)損傷可以促使Nogo-A表達(dá)上調(diào),表明Nogo-A可能在視神經(jīng)損傷的神經(jīng)再生過程中發(fā)揮著重要作用。視神經(jīng)免疫組化表達(dá)早于細(xì)胞形態(tài)變化表達(dá),如何運(yùn)用新的手段通過臨床上超早期運(yùn)用Caspase-3、Nogo-A抑制劑或其他治療手段對(duì)阻止細(xì)胞凋亡死亡具有重要意義,下調(diào)Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)、Nogo-A陽(yáng)性表達(dá)的手段可能就是臨床療效良好的手段。 (4)在急性視神經(jīng)損傷模型建立后視神經(jīng)減壓術(shù)治療、地塞米松及減壓地塞米松治療可能在早期(1d)防止急性視神經(jīng)損傷后RGC細(xì)胞凋亡,對(duì)急性視神經(jīng)損傷后視神經(jīng)及視網(wǎng)膜21天作用無(wú)明顯差異,P0.05,且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,三種治療對(duì)急性視神經(jīng)損傷后RGC細(xì)胞保護(hù)作用不確定。地塞米松的治療應(yīng)在一周,一周以上可能無(wú)效或可能產(chǎn)生相反作用機(jī)制。視神經(jīng)特殊生理解剖特性,在一定損傷后病理潰變?cè)谀壳爸委熓侄蜗戮哂胁豢赡孓D(zhuǎn)的趨勢(shì)。原發(fā)視神經(jīng)損傷程度決定預(yù)后。 (5)本研究結(jié)果顯示：三種治療方法不能有效減少視神經(jīng)損傷后視神經(jīng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡數(shù)目,但其確切機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚需進(jìn)一步的分析。但三者最終結(jié)果差異小,可能目前臨床治療手段不佳,手術(shù)減壓需盡早去除鞘外壓迫組織,治療方向需要調(diào)整,仍需大量多方向多角度進(jìn)一步研究。目前視神經(jīng)損傷治療應(yīng)朝抗細(xì)胞凋亡方向發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R774.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1465082