本文關鍵詞： 晚期糖基化終末產(chǎn)物 晚期糖基化終末產(chǎn)物受體 糖尿病性白內(nèi)障　出處：《第四軍醫(yī)大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景: 糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract, DC)是糖尿病并發(fā)癥中僅次于視網(wǎng)膜病變的第二大致盲性眼病。糖尿病患者體內(nèi)積聚的大量晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end-products, AGEs)同其受體(receptor for advanced glycation end-products, RAGE)結合后,能夠引起細胞內(nèi)活性氧簇合成增多、核因子轉錄活性增加等細胞反應,造成組織氧化損傷、炎癥反應,是AGEs在人體內(nèi)發(fā)揮作用并導致疾病的一個重要途徑。目的:本課題旨在通過觀察RAGE在糖尿病性白內(nèi)障、年齡相關性白內(nèi)障及正常晶狀體上皮細胞中的表達情況,體外實驗研究AGEs對于人晶狀體上皮細胞氧化狀態(tài)以及RAGE表達的影響,初步探討兩者相互作用在糖尿病性白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展中的作用及可能機制,為糖尿病性白內(nèi)障基礎研究及藥物防治提供新思路和實驗依據(jù)。 方法: (1)收集70例糖尿病性白內(nèi)障、72例年齡相關性白內(nèi)障及24例正常晶狀體前囊膜;收集糖尿病性白內(nèi)障患者性別、年齡、糖尿病病程、糖化血紅蛋白水平、白內(nèi)障類型以及是否伴發(fā)糖尿病視網(wǎng)膜病變等6項臨床資料。采用免疫組化的方法檢測RAGE在糖尿病性白內(nèi)障、年齡相關性白內(nèi)障及正常晶狀體上皮細胞上的表達;分別比較并分析RAGE在糖尿病性白內(nèi)障、年齡相關性白內(nèi)障及正常晶狀體上皮細胞中的表達差異;使用logistic回歸分析法分析糖尿病患者晶狀體上皮細胞中RAGE表達同6項臨床資料間的相關性。 (2)體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞系(SRA01/04),實驗組分別加入濃度為0 mg/ml、0.25 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml的AGE-BSA;對照組則分別加入相同濃度梯度的對照牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA),同細胞共孵育24h后:使用ROS檢測試劑盒,流式細胞技術觀測各組細胞內(nèi)ROS的含量;使用GSH及GSSG檢測試劑盒,比色法測算各組細胞內(nèi)GSSG/GSx比值;使用免疫印記法檢測各組細胞中RAGE表達的情況。(3)體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞系(SRA01/04),實驗組加入濃度為0.5 mg/ml的AGE-BSA;對照組加入相同濃度的對照BSA,分別觀察各組加入干預或?qū)φ赵噭┑?、2、8、16、24h后: ROS含量的變化,GSSG/GSx比值的改變以及RAGE的表達情況。 結果: (1)①糖尿病性白內(nèi)障及年齡相關性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜上皮細胞均可見有RAGE不同程度的陽性著色。而透明晶狀體前囊膜則未見類似著色。RAGE在糖尿病性白內(nèi)障晶狀體及透明晶狀體上皮細胞上的表達間存在顯著性差異(P0.0125);RAGE在年齡相關性白內(nèi)障及透明晶狀體上皮細胞上的表達間存在顯著性差異(P0.0125);RAGE在糖尿病性白內(nèi)障晶狀體及年齡相關性白內(nèi)障晶狀體上皮細胞上的表達間存在顯著性差異(P0.0125)。 ②臨床數(shù)據(jù)中糖尿病病程和糖化血紅蛋白水平,與RAGE表達情況的相關性具有統(tǒng)計學意義(P0.05),并且這種相關性為正相關(OR1),而其他4項包括患者性別、年齡、白內(nèi)障類型以及是否伴發(fā)有糖尿病視網(wǎng)膜病變同RAGE表達情況的相關性則不具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 (2)①隨著AGEs作用濃度的增加, ROS含量不斷增加,但在對照組,細胞內(nèi)ROS含量無明顯變化。在干預濃度為0 mg/ml及0.25 mg/ml時,作用24 h后,實驗組及對照組細胞內(nèi)ROS含量無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05);在干預濃度為0.50 mg/ml及1.00 mg/ml時,作用24 h后,實驗組及對照組ROS含量存在顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。隨著AGEs作用濃度的增加,細胞內(nèi)GSSG/GSx也不斷增加:實驗組細胞內(nèi)GSSG/GSx的比值,從初始干預濃度為0 mg/ml時的1.7±0.26%,增長至干預濃度為1.00 mg/m時的12.83±0.40%,而對照組則無明顯變化。在濃度為0 mg/ml及0.25 mg/ml時,作用24 h后,實驗組及對照組GSSG/GSx無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05);在濃度為0.50 mg/ml及1.00 mg/ml時,作用24 h后,實驗組及對照組GSSG/GSx存在顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。 ②AGEs能夠誘導晶狀體上皮細胞RAGE在蛋白質(zhì)水平上的表達增加:隨著AGEs濃度的增加,晶狀體上皮細胞內(nèi)RAGE蛋白表達不斷增加;在AGEs濃度為0.5 mg/ml及1.00 mg/ml時,RAGE蛋白表達較對照組顯著增加(P0.05)。 ③隨著AGEs作用時間的增加,細胞內(nèi)ROS含量不斷增加,這種增加在干預后0、2、8 h時變化不明顯,而在干預后第16 h及24 h時ROS的增加則較為明顯。但在對照組,ROS的含量并無明顯變化。在干預后第16 h及24 h時,實驗組細胞內(nèi)ROS含量明顯高于對照組,存在明顯統(tǒng)計學差異(P0.05)。隨著AGEs作用時間的增加,細胞內(nèi)GSSG/GSx也不斷增加:實驗組細胞內(nèi)GSSG/GSx的比值,在干預后0 h時的0.63±0.15%,增長至24 h時的10.63±0.40%。但在對照組,GSSG/GSx比值未出現(xiàn)明顯變化。在AGEs作用于細胞初始的8 h內(nèi),細胞內(nèi)GSSG/GSx的比值增長迅速,而在其后的16 h內(nèi),這種增長變得較為平緩。比較相同作用時間內(nèi)實驗組及對照組GSSG/GSx的比值,各組間具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。 ④AGEs能夠誘導晶狀體上皮細胞RAGE在蛋白質(zhì)水平的表達增加:隨著AGEs作用時間的延長,RAGE表達水平不斷增高;在作用時間為16 h及24 h時,同對照組相比,表達具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論: RAGE在糖尿病性白內(nèi)障及年齡相關性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細胞中高表達,在正常透明晶狀體上皮細胞中幾乎不表達;AGEs能夠改變晶狀體上皮細胞氧化狀態(tài),上調(diào)RAGE的表達;AGEs-RAGE相互作用可能在糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病中起重要作用。
[Abstract]:Research background:
Diabetic cataract (diabetic cataract DC) is a complication of diabetes retinopathy after approximately second blind eye disease in diabetes. The accumulation of a large number of advanced glycation end products (advanced glycation, end-products, AGEs) and its receptor (receptor for advanced glycation end-products, RAGE) combined, can cause the synthesis of reactive oxygen species in the cell increase, enhance the transcription activity of nuclear factor cell reaction, cause oxidative tissue damage, inflammation, AGEs play a role in the human body is an important way to cause disease. Objective: This study is designed to observe the expression of RAGE in diabetic cataract, age-related cataract and normal lens epithelial cells in vitro. Experimental Study on the influence of AGEs on oxidation state of human lens epithelial cells and the expression of RAGE, a preliminary exploration of the interaction between the two The role and possible mechanism in the development of diabetic cataract can provide new ideas and experimental basis for the basic research and drug control of diabetic cataract.
Method:
(1) collected 70 cases of diabetic cataract, 72 cases of age-related cataract and 24 cases of normal anterior capsule; diabetic cataract patients with gender, age, duration of diabetes, HbA1c levels, and whether the type of cataract associated with diabetic retinopathy and 6 clinical data. Immunohistochemical method was used to detect RAGE in diabetic cataract, expression of age-related cataract and normal lens epithelial cells; compare and analyze the RAGE expression in diabetic cataract, age-related cataract and normal lens epithelial cells; using logistic regression analysis to analyze the expression of RAGE correlated with the 6 clinical data between the epithelial cells of diabetic patients in the lens.
(2) human lens epithelial cells cultured in vitro (SRA01/04), the experimental group were added at a concentration of 0 mg/ml, 0.25 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1 mg/ml AGE-BSA; the control of bovine serum albumin in control group were cultured in the same concentration gradient (bovine serum, albumin, BSA), after 24h cells were incubated with: ROS kit and flow cytometry were observed in ROS cells; using GSH and GSSG test kit, colorimetric method to measure the intracellular GSSG/GSx ratio; using Western blot to detect the expression of RAGE of cells. (3) human lens epithelial cells cultured in vitro (SRA01/04), experimental group with a concentration of 0.5 mg/ml AGE-BSA; control group BSA with the same concentration, were observed with the 0,2,8,16,24h after the intervention or control reagent: the changes of ROS content, GSSG/GSx ratio change and the expression of RAGE.
Result:
(1) of diabetic cataract and age-related cataract lens anterior capsule epithelial cells were observed RAGE positive staining in different degrees. There is a significant difference between the expression of transparent lens capsule coloring.RAGE in diabetic cataract lens and lens epithelial cells (P0.0125); the significant the differential expression of RAGE in age-related cataract and transparent lens epithelial cells on the (P0.0125); there was a significant difference between the expression of RAGE in diabetic cataract and age-related cataract lens epithelial cells on the (P0.0125).
The clinical data of diabetes and HbA1c levels, and the correlation between the expression of RAGE was statistically significant (P0.05), and the correlation between positive correlation (OR1), while the other 4 patients including gender, age, type of cataract and whether there is associated with diabetic retinopathy with the expression of RAGE was not statistically meaning (P0.05).
(2) with the increase of AGEs concentration, ROS content increased, but in the control group, the content of ROS in cells. No significant changes in the intervention concentration of 0 mg/ml and 0.25 mg/ml, 24 h, the experimental group and the control group the content of ROS cells had no significant difference (P0.05) in the intervention; the concentration of 0.50 mg/ml and 1 mg/ml, 24 h, the experimental group and the control group ROS. There was significant difference (P0.05). With the increase of the concentration of AGEs, intracellular GSSG/GSx increased ratio of experimental group GSSG/GSx cells, from the initial dry pre concentration was 0 mg/ml 1.7 + 0.26% to increase, intervention concentration was 1 mg/m 12.83 + 0.40%, while the control group had no obvious change. At the concentration of 0 mg/ml and 0.25 mg/ml, 24 h, experimental group and control group GSSG/GSx had no significant difference (P0.05); at the concentration of 0.50 mg/ml and 1 mg/ml, as After 24 h, there were significant differences in GSSG/GSx between the experimental group and the control group (P0.05).
The increased expression of AGEs can induce RAGE lens epithelial cells at the protein level, with the increase of AGEs concentration, the expression of RAGE protein in lens epithelial cells increased; when the concentration of AGEs was 0.5 mg/ml and 1 mg/ml, RAGE protein expression increased significantly compared with the control group (P0.05).
With the increase of AGEs time, intracellular ROS content increased, the increase in 0,2,8 after the intervention of h did not change significantly, but after the intervention of sixteenth h and 24 h ROS increased obviously. But in the control group, no significant changes in the content of ROS. After the intervention of sixteenth h and 24 h when the content of ROS in experimental group cells was significantly higher than control group, there was statistically significant difference (P0.05). With the increase of AGEs. The intracellular GSSG/GSx increased ratio of experimental group GSSG/GSx cells, 0.63 + 0.15% at 0 h after the intervention, increased to 24 when h 10.63 + 0.40%. but in the control group, the GSSG/GSx ratio did not change significantly. The effect of AGEs on the cell in the initial 8 h, the ratio of increase of intracellular GSSG/GSx quickly, and then the 16 h, the growth became slow. The same time the experimental group and control group than GSSG/GSx There was a statistical difference between each group (P0.05).
(4) AGEs can induce increased expression of RAGE in the protein level of lens epithelial cells: with the prolongation of AGEs action time, the level of RAGE expression is increasing. When the action time is 16 h and 24 h, the expression is statistically significant compared with the control group (P0.05).
Conclusion:
The high expression of RAGE in lens epithelial cells in cataract patients with diabetic cataract and age-related, almost no expression in normal lens epithelial cells; AGEs can change the redox state of LECs, upregulating the expression of RAGE; AGEs-RAGE interaction may play an important role in the pathogenesis of diabetic cataract.

【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R587.1;R776.1

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