本文關鍵詞： 喉鱗狀細胞癌 RhoC ALDH1A1 腫瘤干細胞 轉移　出處：《中國人民解放軍醫(yī)學院》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的： 通過外源基因導入技術抑制和增強喉鱗狀細胞癌細胞-Hep2中RhoC(Ras homology C,Ras同源類似物C)表達，觀察腫瘤細胞凋亡、運動、形態(tài)學變化及腫瘤干細胞標記物ALDH1A1（Aldehydedehydrogenase1family, member A1乙醛脫氫酶1A1）表達的變化，研究RhoC對喉鱗狀細胞癌生物學行為及腫瘤起始細胞群-腫瘤干細胞的影響，為以RhoC為治療靶點控制喉鱗癌的轉移提供實驗支持。 方法： （1）通過分子生物學方法設計合成干擾RhoC表達可轉錄形成RhoC-shRNA（RhoC-short hairpin ribonucleic acid,RhoC短發(fā)卡核糖核酸）從而抑制RhoC表達的RhoC-shRNA基因重組質粒GW-shRNA （RhoC-shRNA基因真核表達質粒載體為pENTR/U6-EGFP）和增強RhoC表達的RhoC G14V基因重組質粒13GS03（RhoC G14V基因真核表達質粒載體為pcDNA3.1-EGFP）。（2）運用脂質體轉染方法，將重組質粒轉染至喉鱗狀細胞癌細胞系-Hep2細胞中，并通過轉染條件優(yōu)化，獲得最佳細胞轉染率。（3） QPCR(Real-time Quantitativepolymerasechainreaction Detecting System,實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng))技術檢測影響RhoC表達后Hep2腫瘤干細胞標志物-ALDH1A1的mRNA(messenger ribonucleic acid,信使RNA)表達。（4）TUNEL法檢測影響RhoC表達后Hep2細胞凋亡情況的變化。（5）熒光染色細胞骨架觀察影響RhoC表達后，Hep2細胞的形態(tài)變化。（6）劃痕實驗觀察影響RhoC表達后Hep2細胞的的運動能力的變化。 結果： （1）通過將兩種重組質粒進行基因測序及采用脂質體法轉染293T腎上皮細胞系，證實干擾RhoC表達的重組質粒-GW-shRNA和增強RhoC表達的重組質粒-13GS03構建成功。 （2）24孔板培養(yǎng)條件下，抑制RhoC表達的重組質粒GW-shRNA和增強RhoC表達的重組質粒13GS03與脂質體以1.2μｇ質粒與4.2μl脂質體混合形成的轉染復合物，Hep2喉鱗癌細胞轉染率最高。 （3）抑制Hep2細胞RhoC表達后：腫瘤干細胞標記物ALDH1A1表達顯著降低；凋亡增強；細胞形態(tài)改變明顯，胞體較大，形狀近似多邊形。 （4）增強Hep2細胞RhoC表達后：腫瘤干細胞標記物ALDH1A1及腫瘤細胞凋亡較未處理Hep2細胞變化不顯著；細胞形態(tài)變化明顯，細胞近似梭形，類似間充質細胞形態(tài)，提示細胞運動能力增強。 （5）劃痕實驗檢測細胞運動能力結果顯示抑制RhoC表達使喉鱗癌Hep2腫瘤細胞運動能力減低；增強RhoC表達后Hep2腫瘤細胞運動能力增強。 結論： 1、成功構建抑制RhoC表達重組質粒GW-shRNA和增強RhoC表達重組質粒13GS03，為后續(xù)研究RhoC在喉鱗癌Hep2細胞中的功能奠定了實驗基礎。 2、通過QPCR技術檢測增強RhoC表達后喉鱗狀細胞癌Hep2腫瘤細胞群中腫瘤干細胞標記物ALDH1A1與空白對照組相比無顯著變化，但抑制RhoC表達后ALDH1A1顯著降低，間接說明了RhoC參與喉鱗癌腫瘤干細胞的形成，，在轉移灶起始發(fā)生中具有一定的作用。 3、通過改變Hep2細胞中RhoC表達，觀察腫瘤細胞的凋亡情況，結果顯示增強RhoC表達后細胞腫瘤細胞凋亡現象不明顯，與對照組相比無明顯變化，抑制RhoC表達腫瘤細胞凋亡增強，說明RhoC具有抑制喉鱗癌腫瘤細胞凋亡的作用，提高了腫瘤細胞在轉移擴散中對周圍陌生環(huán)境的適應能力，使具有活性的腫瘤細胞能夠順利到達轉移瘤發(fā)生部位。 4、通過改變RhoC表達觀察Hep2細胞形態(tài)及運動能力的變化，結果顯示，增強RhoC表達后喉鱗癌腫瘤細胞運動能力增強，抑制RhoC表達后腫瘤細胞運動能力減弱，說明RhoC對喉鱗癌腫瘤細胞擴散轉移具有促進作用。 由此可見，RhoC在喉鱗狀細胞癌轉移灶形成中發(fā)揮著重要作用，以RhoC為治療靶點具有重要的臨床應用價值。
[Abstract]:Objective:
Through the technique of introducing foreign gene inhibition and enhancement of RhoC laryngeal squamous cell carcinoma cell line -Hep2 (Ras homology C Ras homolog C) expression, observe the apoptosis of tumor cells, movement, and the morphological changes of tumor stem cell marker ALDH1A1 (Aldehydedehydrogenase1family member, A1 1A1 expression of aldehyde dehydrogenase), RhoC on the biological behavior of larynx squamous cell carcinoma and tumor initiating cells tumor stem cells, RhoC to provide experimental support for the transfer of control target in the treatment of laryngeal squamous cell carcinoma.
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本文編號：1458573