本文關(guān)鍵詞： 喉鱗狀細(xì)胞癌 RhoC ALDH1A1 腫瘤干細(xì)胞 轉(zhuǎn)移　出處：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2014年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： 通過(guò)外源基因?qū)爰夹g(shù)抑制和增強(qiáng)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞-Hep2中RhoC(Ras homology C,Ras同源類(lèi)似物C)表達(dá)，觀察腫瘤細(xì)胞凋亡、運(yùn)動(dòng)、形態(tài)學(xué)變化及腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1A1（Aldehydedehydrogenase1family, member A1乙醛脫氫酶1A1）表達(dá)的變化，研究RhoC對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為及腫瘤起始細(xì)胞群-腫瘤干細(xì)胞的影響，為以RhoC為治療靶點(diǎn)控制喉鱗癌的轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)支持。 方法： （1）通過(guò)分子生物學(xué)方法設(shè)計(jì)合成干擾RhoC表達(dá)可轉(zhuǎn)錄形成RhoC-shRNA（RhoC-short hairpin ribonucleic acid,RhoC短發(fā)卡核糖核酸）從而抑制RhoC表達(dá)的RhoC-shRNA基因重組質(zhì)粒GW-shRNA （RhoC-shRNA基因真核表達(dá)質(zhì)粒載體為pENTR/U6-EGFP）和增強(qiáng)RhoC表達(dá)的RhoC G14V基因重組質(zhì)粒13GS03（RhoC G14V基因真核表達(dá)質(zhì)粒載體為pcDNA3.1-EGFP）。（2）運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系-Hep2細(xì)胞中，并通過(guò)轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化，獲得最佳細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。（3） QPCR(Real-time Quantitativepolymerasechainreaction Detecting System,實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng))技術(shù)檢測(cè)影響RhoC表達(dá)后Hep2腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物-ALDH1A1的mRNA(messenger ribonucleic acid,信使RNA)表達(dá)。（4）TUNEL法檢測(cè)影響RhoC表達(dá)后Hep2細(xì)胞凋亡情況的變化。（5）熒光染色細(xì)胞骨架觀察影響RhoC表達(dá)后，Hep2細(xì)胞的形態(tài)變化。（6）劃痕實(shí)驗(yàn)觀察影響RhoC表達(dá)后Hep2細(xì)胞的的運(yùn)動(dòng)能力的變化。 結(jié)果： （1）通過(guò)將兩種重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序及采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293T腎上皮細(xì)胞系，證實(shí)干擾RhoC表達(dá)的重組質(zhì)粒-GW-shRNA和增強(qiáng)RhoC表達(dá)的重組質(zhì)粒-13GS03構(gòu)建成功。 （2）24孔板培養(yǎng)條件下，抑制RhoC表達(dá)的重組質(zhì)粒GW-shRNA和增強(qiáng)RhoC表達(dá)的重組質(zhì)粒13GS03與脂質(zhì)體以1.2μｇ質(zhì)粒與4.2μl脂質(zhì)體混合形成的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，Hep2喉鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染率最高。 （3）抑制Hep2細(xì)胞RhoC表達(dá)后：腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1A1表達(dá)顯著降低；凋亡增強(qiáng)；細(xì)胞形態(tài)改變明顯，胞體較大，形狀近似多邊形。 （4）增強(qiáng)Hep2細(xì)胞RhoC表達(dá)后：腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1A1及腫瘤細(xì)胞凋亡較未處理Hep2細(xì)胞變化不顯著；細(xì)胞形態(tài)變化明顯，細(xì)胞近似梭形，類(lèi)似間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，提示細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。 （5）劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力結(jié)果顯示抑制RhoC表達(dá)使喉鱗癌Hep2腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減低；增強(qiáng)RhoC表達(dá)后Hep2腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建抑制RhoC表達(dá)重組質(zhì)粒GW-shRNA和增強(qiáng)RhoC表達(dá)重組質(zhì)粒13GS03，為后續(xù)研究RhoC在喉鱗癌Hep2細(xì)胞中的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2、通過(guò)QPCR技術(shù)檢測(cè)增強(qiáng)RhoC表達(dá)后喉鱗狀細(xì)胞癌Hep2腫瘤細(xì)胞群中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1A1與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著變化，但抑制RhoC表達(dá)后ALDH1A1顯著降低，間接說(shuō)明了RhoC參與喉鱗癌腫瘤干細(xì)胞的形成，，在轉(zhuǎn)移灶起始發(fā)生中具有一定的作用。 3、通過(guò)改變Hep2細(xì)胞中RhoC表達(dá)，觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示增強(qiáng)RhoC表達(dá)后細(xì)胞腫瘤細(xì)胞凋亡現(xiàn)象不明顯，與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，抑制RhoC表達(dá)腫瘤細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，說(shuō)明RhoC具有抑制喉鱗癌腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，提高了腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中對(duì)周?chē)吧h(huán)境的適應(yīng)能力，使具有活性的腫瘤細(xì)胞能夠順利到達(dá)轉(zhuǎn)移瘤發(fā)生部位。 4、通過(guò)改變RhoC表達(dá)觀察Hep2細(xì)胞形態(tài)及運(yùn)動(dòng)能力的變化，結(jié)果顯示，增強(qiáng)RhoC表達(dá)后喉鱗癌腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，抑制RhoC表達(dá)后腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力減弱，說(shuō)明RhoC對(duì)喉鱗癌腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用。 由此可見(jiàn)，RhoC在喉鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移灶形成中發(fā)揮著重要作用，以RhoC為治療靶點(diǎn)具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:Objective:
Through the technique of introducing foreign gene inhibition and enhancement of RhoC laryngeal squamous cell carcinoma cell line -Hep2 (Ras homology C Ras homolog C) expression, observe the apoptosis of tumor cells, movement, and the morphological changes of tumor stem cell marker ALDH1A1 (Aldehydedehydrogenase1family member, A1 1A1 expression of aldehyde dehydrogenase), RhoC on the biological behavior of larynx squamous cell carcinoma and tumor initiating cells tumor stem cells, RhoC to provide experimental support for the transfer of control target in the treatment of laryngeal squamous cell carcinoma.
Method錛

本文編號(hào)：1458573