發(fā)布時間：2018-01-20 08:16

  本文關鍵詞： 增齡相關聽力損失 耳蝸 卡那霉素 TMPRSS3 增齡相關聽力損失 耳蝸 基因表達 ENaC-α　出處：《中南大學》2010年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 研究背景：跨膜絲氨酸蛋白酶3(TMPRSS3)為Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶家族成員,是第一個被發(fā)現(xiàn)的致聾的蛋白酶,其基因缺陷是非綜合征型常染色體隱性遺傳性聾DFNB8/10的遺傳學基礎,至今已發(fā)現(xiàn)該基因14種突變致聾形式,但對于該蛋白酶的功能及其作用機制仍不清楚。 目的：本研究在增齡相關性聽力損失和卡那霉素致聾的SD大鼠模型上,通過檢測耳蝸中TMPRSS3基因的表達特點,初步探討其在增齡相關性聽力損失及藥物中毒性聾中的作用。 方法：用于卡那霉素致聾研究的大鼠均為3月齡,隨機分為四組：Ⅰ組(對照組)：注射生理鹽水14天；Ⅱ組(卡那霉素3日組)：肌注硫酸卡那霉素,連續(xù)3天；Ⅲ組(卡那霉素7日組)：肌注硫酸卡那霉素,連續(xù)7天；Ⅳ組(卡那霉素14日組)：肌注硫酸卡那霉素,連續(xù)14天。用于增齡相關性聾的大鼠按月齡分為三組：3月齡組、12月齡組、24月齡組。通過聽性腦干反應(ABR)測試確定各組8 kHz和16kHz的聽反應閾。應用免疫組化技術檢測各組大鼠耳蝸中TMPRSS3蛋白的表達與分布情況。應用Western blot技術檢測耳蝸中TMPRSS3蛋白表達水平。應用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(RT-PCR)對大鼠耳蝸中TMPRSS3基因的mRNA表達水平進行檢測。 結(jié)果：1.卡那霉素致聾大鼠：(1)聽功能改變：ABR反應閾由高到低依次為：卡那霉素14日組卡那霉素7日組卡那霉素3日組,而對照組與注射3日組之間ABR反應閾值無明顯差異。(2)免疫組化染色：TMPRSS3蛋白在各組SD大鼠耳蝸中均有表達,隨注射時間延長,染色陽性程度變?nèi)酢?3)Western blot檢測：TMPRSS3蛋白在耳蝸的表達濃度隨著注射時間延長而減弱。(4)RT-PCR分析：抽提耳蝸組織總RNA電泳結(jié)果OD260/280在1.9-2.0之間。TMPRSS3基因的mRNA表達水平隨注射時間延長而逐漸下降。 2.增齡相關性聽力損失大鼠：(1)聽功能改變：在16kHz, ABR反應閾由高到低依次為：24月齡組12月齡組3月齡組,各組間均有顯著差異(P0.01)。在8kHz,24月齡組較3月齡及12月齡組大鼠閾值增高,而3月齡和12月齡組之間無顯著差異；(2)免疫組化染色：隨月齡增長,TMPRSS3蛋白耳蝸染色陽性程度變?nèi)酢?3)Western blot檢測：大鼠耳蝸中TMPRSS3蛋白.表達濃度隨年齡增長而減弱。(4)RT-PCR分析：TMPRSS3 mRNA表達水平隨月齡增長而減弱,各組間均有顯著差異。 結(jié)論：TMPRSS3在SD大鼠耳蝸螺旋器和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞均有表達。SD大鼠耳蝸中TMPRSS3蛋白和mRNA表達水平隨注射硫酸卡那霉素時間增長和月齡增長而逐漸降低。各實驗組TMPRSS3蛋白和mRNA表達水平與聽功能保存程度基本一致。上述結(jié)果提示TMPRSS3可能在藥物中毒和老年性聾的發(fā)生中起作用。 研究背景：表皮鈉通道蛋白(ENaC)屬于ENaC/Deg家族,是由3個同源亞基α、β、γ組成的多聚體,分布于腎小管、結(jié)腸、呼吸道上皮細胞表面及耳蝸等處,在耳蝸其主要作用是維持內(nèi)淋巴的低鈉濃度。2002年Guipponi等利用體外爪蟾卵表達系統(tǒng),證實了TMPRSS3能催化激活ENaC。也有研究發(fā)現(xiàn)TMPRSS3致聾的突變體無法激活ENaC。但目前對于ENaC在調(diào)節(jié)內(nèi)耳內(nèi)淋巴代謝、維持內(nèi)耳正常功能方面的機制尚不清楚。 目的：本研究在對增齡相關性聽力損失和卡那霉素致聾的SD大鼠,通過檢測耳蝸中ENaC-α基因的表達特點,初步探討其在老年性聾及藥物性聽力損失中的作用,及與TMPRSS3的關系。 方法：動物分組處理同第一部分,應用免疫組化技術,檢測各組SD大鼠耳蝸中ENaC-α蛋白的表達與分布情況。應用Western blot技術,檢測兩類致聾模型大鼠耳蝸中ENaC-α的蛋白表達水平。應用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(RT-PCR),對大鼠耳蝸中ENaC-α基因的mRNA表達水平進行檢測。 結(jié)果：1.卡那霉素致聾大鼠：(1)免疫組化染色：ENaC-α蛋白在各組SD大鼠耳蝸中均有表達,注射14日組大鼠較注射3日、7日組及對照組的大鼠耳蝸染色明顯減弱,但注射3日、7日組及對照組之間無顯著差異；(2)Western blot檢測：對照組及注射3日、7日的大鼠耳蝸蛋白表達濃度無明顯改變,注射14日組較前三組ENaC-α蛋白濃度明顯降低。(3)RT-PCR分析：抽提耳蝸組織總RNA電泳結(jié)果OD260/280在1.9-2.0之間。注射3日、7日及對照組的大鼠耳蝸mRNA表達水平無明顯改變,注射14日組ENaC-αmRNA表達水平較前三組減弱,有統(tǒng)計學顯著差異。 2.增齡相關聽力損失大鼠：(1)免疫組化染色：SD大鼠隨月齡增長,耳蝸ENaC-α蛋白染色陽性程度減弱。(2)Western blot檢測：ENaC-α蛋白表達濃度隨大鼠月齡增長而降低。(3)RT-PCR分析：大鼠耳蝸ENaC-αmRNA表達水平隨月齡增長逐漸減弱,有顯著差異。 結(jié)論：ENaC-α在SD大鼠耳蝸Corti's器和螺旋神經(jīng)節(jié)細胞均有表達�？敲顾刂旅@大鼠耳蝸中ENaC-α蛋白和mRNA表達水平在給藥后期明顯降低；增齡相關聽力損失大鼠隨月齡增大而降低。ENaC-α的變化與TMPRSS3有相關性,提示TMPRSS3可能通過調(diào)節(jié)ENaC-α而起作用。
[Abstract]:Background: transmembrane serine protease 3 (TMPRSS3) is a type II transmembrane serine protease family members, is the first found of hearing loss caused by protease, the genetic defect is non genetic basis of syndrome type of autosomal recessive deafness DFNB8/10, has been found in the gene mutation of deafness caused by 14 kinds of forms, but the effect and mechanism of the protease function remains unclear.
Objective: To investigate the role of TMPRSS3 gene in aging related hearing loss and drug induced hearing loss in a SD rat model with hearing loss and kanamycin induced hearing loss.
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本文編號：1447510