發(fā)布時間：2018-01-18 13:13

  本文關(guān)鍵詞：超順磁氧化鐵納米粒介導(dǎo)bFGF轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細胞　出處：《蘇州大學(xué)》2011年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 超順磁氧化鐵納米粒子 pEGFP-C1 bFGF 基因轉(zhuǎn)染

【摘要】：目的 用經(jīng)過多聚賴氨酸修飾的超順磁氧化鐵納米粒子作為基因載體,將攜帶堿性成纖維生長因子的綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-C1-bFGF轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的貓角膜內(nèi)皮細胞,并初步研究其轉(zhuǎn)染效果,探討超順磁氧化鐵納米粒子作為一種新型基因載體進行體外角膜內(nèi)皮細胞基因轉(zhuǎn)染的可行性。 本實驗分兩部分: 第一部分:貓角膜內(nèi)皮細胞培養(yǎng)及鑒定。 第二部分:超順磁氧化鐵納米粒介導(dǎo)pEGFP-C1-bFGF基因轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細胞及其表達的觀察。 方法 第一部分:無菌條件下取貓齡小于3個月的貓眼球,沿角膜緣剪開取角膜片,按揭取后彈力層培養(yǎng)法進行角膜內(nèi)皮細胞的原代及傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察不同階段培養(yǎng)的細胞的形態(tài),用臺盼藍染色計數(shù)各代活細胞的百分數(shù)。并用NSE抗體對傳代培養(yǎng)的細胞進行鑒定,觀察傳代細胞是否保持有角膜內(nèi)皮細胞的特性。 第二部分:用多聚賴氨酸為修飾物,使多聚賴氨酸通過靜電作用結(jié)合于超順磁氧化鐵納米粒子表面,獲得多聚賴氨酸-超順磁氧化鐵納米粒子復(fù)合物(SPIONs—PLL)。借助含有報告基因的真核表達載體pEGFP-C1,用SPIONs—PLL作為基因載體,將bFGF基因轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的貓角膜內(nèi)皮細胞。在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,并繼續(xù)觀察bFGF基因表達情況。 結(jié)果 第一部分:體外成功培養(yǎng)原代貓角膜內(nèi)皮細胞,并傳到第4代。其中原代與1代細胞生長良好,細胞呈鋪路石樣向周邊鋪展擴增,大部細胞形態(tài)呈規(guī)則多邊形、生長狀態(tài)好,活細胞的百分數(shù)分別為99.8%,99.1%。而從2代開始的角膜內(nèi)皮細胞貼壁和增殖能力開始減弱,傳至3代細胞形態(tài)變大不規(guī)則、胞質(zhì)內(nèi)空泡漸增多,細胞數(shù)量漸少,活細胞的百分數(shù)分別為98.2%,94.3%,91.3%。傳代培養(yǎng)的貓角膜內(nèi)皮細胞用NSE鑒定,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)抗體NSE的陽性表達。 第二部分:獲得密度均勻的SPIONs—PLL懸浮溶液。由于SPIONs—PLL在中性溶液中帶正電,顆粒彼此間存在靜電斥力,可以抵消部分重力作用,所以SPIONs—PLL在久置后仍處于懸浮狀態(tài)。并且成功將pEGFP-C1-bFGF基因轉(zhuǎn)染入貓角膜內(nèi)皮細胞,48 h后熒光顯微鏡下可見特異性的綠色熒光,未轉(zhuǎn)染的細胞未見綠色熒光,轉(zhuǎn)染細胞與未轉(zhuǎn)染細胞均生長良好。經(jīng)western blot檢測,證明轉(zhuǎn)染攜帶有bFGF基因質(zhì)粒的細胞中bFGF基因表達顯著增高。 結(jié)論 1、體外利用揭取后彈力層法能夠成功培養(yǎng)出角膜內(nèi)皮細胞并傳代,隨著細胞的傳代細胞增殖能力減弱,繼續(xù)傳代能力差。傳代細胞經(jīng)NSE鑒定呈陽性表達,證明本實驗所培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細胞為神經(jīng)嵴來源的細胞。 2、經(jīng)多聚賴氨酸修飾的超順磁氧化鐵納米粒子可作為基因載體將pEGFP-C1-bFGF基因轉(zhuǎn)染入貓角膜內(nèi)皮細胞并得到表達,轉(zhuǎn)染的細胞生長良好。且超順磁氧化鐵納米粒子所具有的超順磁性可達到在外加磁場條件下提高轉(zhuǎn)染效率的效果。說明超順磁氧化鐵納米粒子可作為一種新型基因載體在基因工程細胞轉(zhuǎn)染方面具有較大的可行性。
[Abstract]:objective
After using poly-L-lysine modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles as gene carrier, will carry the basic culture of fibroblast growth factor GFP plasmid pEGFP-C1-bFGF was transfected into in vitro cat corneal endothelial cells, and to study the effect of transfection, superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a novel gene vector for gene in vitro cornea the feasibility of transfection of endothelial cells.
The experiment is divided into two parts:
Part 1: culture and identification of corneal endothelial cells in cat's cornea.
The second part: Ultraparamagnetic iron oxide nanoparticles mediated pEGFP-C1-bFGF gene transfection in cat corneal endothelial cells and their expression.
Method
The first part: sterilely cat age less than 3 months of the cat eye, along the limbus cornea cut to take the mortgage, Descemet culture method of corneal endothelial cells and cultured in different stages. Observe the morphology of cultured cells under the inverted microscope, the percentage of each generation counting with trypan. Cell blue staining. And NSE antibody on cultured cells were identified and observed whether cell maintain characteristics of corneal endothelial cells.
The second part: the use of poly lysine as modifier, the poly lysine by electrostatic interaction combined with superparamagnetic iron oxide nanoparticles, obtain polylysine superparamagnetic iron oxide nanoparticle composites (SPIONs - PLL). The eukaryotic expression vector pEGFP-C1 containing reporter gene, SPIONs PLL as gene vector, bFGF gene was transfected into in vitro cultured cat corneal endothelial cells. The transfection efficiency was observed under the inverted fluorescence microscope, and to observe the expression of bFGF gene.
Result
The first part: the primary cultured cat corneal endothelial cells were cultured successfully, and spread to the fourth generation. One original and 1 generation cells grew well, cells showed cobblestone amplification to the surrounding spreading of the cells showed irregular polygons, growth state, percentage of living cells was 99.8% 99.1%., and from the beginning of the 2 generation the corneal endothelial cell adherence and proliferation ability began to weaken, spread to the 3 generation cells became larger and irregular, cytoplasmic vacuoles gradually increased, the number of cells gradually less, percentage of living cells were 98.2%, 94.3%, 91.3%. were cultured cat corneal endothelial cells were identified by NSE, the positive expression of NSE cell antibody in the matter.
The second part: SPIONs PLL suspended solution density uniform. Because the SPIONs - PLL in neutral solution are positively charged, electrostatic repulsion between particles, can be partially offset the effect of gravity, so SPIONs PLL in long after the suspension is still in the state. And the success of the pEGFP-C1-bFGF gene was transfected into cat corneal endothelial cells, 48 h under the fluorescence microscope after visible specific green fluorescence, the green fluorescence of untransfected cells were transfected cells and untransfected cells were growing well. By Western blot assay, the expression of bFGF that transfected with bFGF gene plasmid genes was significantly increased.
conclusion
1, in vitro by stripping Descemet method successfully cultured corneal endothelial cells proliferation and passage, with the reduced ability of cell to cell, passage ability. Cells were identified by NSE positive expression, prove the cultured corneal endothelial cells from neural crest cells.
2, the poly lysine modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles can be used as a gene vector pEGFP-C1-bFGF gene transfection in cat corneal endothelial cells and expression of transfected cells grew well. And super paramagnetic iron oxide superparamagnetic nanoparticles can improve transfection efficiency in the presence of an external magnetic field effect. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles can be used as a new gene carrier has great feasibility in gene engineering cell transfection.

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R77

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉春忻;;bFGF、FGFR1和FGFR2在子宮內(nèi)膜癌的表達和臨床意義[J];中國實驗診斷學(xué);2011年08期

2 李竹英;王晶波;初云海;;通腑湯對急性肺損傷大鼠模型bFGF的影響[J];實用中醫(yī)內(nèi)科雜志;2010年11期

3 陳大芳;易鳳瓊;呂碧瓊;;孵育雞蛋膜對深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面bFGF、EGF表達的影響及意義[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2011年08期

4 何偉星;葉偉成;李洪勝;王遠東;王金龍;陳貴全;楊嶸皓;;VEGF、bFGF與血管內(nèi)皮抑素在NSCLC治療中的相關(guān)性研究[J];實用臨床醫(yī)藥雜志;2011年13期

5 王春渤;馬世偉;張志宇;李奇;辛?xí)程?;bFGF復(fù)合降解膜促進腱內(nèi)部再生的實驗研究[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2011年06期

6 郝偉;姜明;周東生;王新;劉洪智;周路綱;孫煜杰;;rhBMP-2、bFGF雙基因共轉(zhuǎn)染兔骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合nHA/RHLC/PLA支架及其體內(nèi)外成骨分化研究[J];中國矯形外科雜志;2011年13期

7 郭少賢;劉永惠;常靖;夏欣欣;王瑞;華莎;;麝香酮干預(yù)血瘀證乳腺癌組織血管生成相關(guān)因子表達研究[J];河北中醫(yī)藥學(xué)報;2011年02期

8 王維軍;李嗣生;牛東生;劉法銀;孫軍;張子峰;;股骨頭缺血性壞死骨質(zhì)含量與VEGF、bFGF、BMP-2 mRNA表達的相關(guān)性研究[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2011年08期

9 馬傳香;李騫;高昆山;王海英;劉慧榮;王樹慶;;白血病患者骨髓中CD105、VEGF及bFGF的表達及臨床意義[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2011年16期

10 明磊國;葛寶豐;陳克明;馬慧萍;翟遠坤;;異補骨脂素對體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞增殖與成骨性分化的研究[J];中國中藥雜志;2011年15期

相關(guān)會議論文 前10條

1 趙沁慧;王光義;;電針對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織Nestin及bFGF表達的影響[A];2011中國針灸學(xué)會年會論文集（摘要）[C];2011年

2 楊卓欣;卓緣圓;;電針對脾虛型幼鼠腦內(nèi)堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及其mRNA表達的影響[A];2011中國針灸學(xué)會年會論文集（摘要）[C];2011年

3 于虎;張國新;李艷;車永哲;母義明;;重組Tβ4調(diào)節(jié)bFGF和TNF-α表達促進糖尿病大鼠皮膚損傷愈合[A];中華醫(yī)學(xué)會第十次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

4 陳彪;陳廖斌;秦俊;汪暉;Jaques Magdalou;;bFGF及相關(guān)細胞因子轉(zhuǎn)染對人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的作用[A];全國第十二屆生化與分子藥理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

5 趙忠芳;呂仁榮;霍然;傅洪濱;徐廣琪;馬少林;;口服普萘洛爾治療血管瘤患者bFGF的變化[A];中華醫(yī)學(xué)會整形外科學(xué)分會第十一次全國會議、中國人民解放軍整形外科學(xué)專業(yè)委員會學(xué)術(shù)交流會、中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會醫(yī)學(xué)美容專業(yè)委員會全國會議論文集[C];2011年

6 耿琪瑛;孫喜平;孫奎;馮立國;;基因重組bFGF在燒傷創(chuàng)面的應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會第六屆全國燒傷外科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2001年

7 孫黎光;于卉影;彭博;張頤;劉寧;王曉鵬;;PKB介導(dǎo)的bFGF對肝癌細胞周期素A表達的影響[A];第七屆全國酶學(xué)學(xué)術(shù)討論會論文摘要集[C];2004年

8 王碩;林曉;沈嵐;梁爽;徐德生;馮怡;丁侃;;麥冬多糖通過誘導(dǎo)S1P、bFGF表達保護缺血心肌生存及促進血管生成作用[A];2010年中國藥學(xué)大會暨第十屆中國藥師周論文集[C];2010年

9 王華利;;注射川芎嗪(TMP)對大鼠肌腱堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原產(chǎn)生的抑制[A];第6屆全國青年體育科學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2011年

10 劉銘雅;魏盟;虞勇;趙強;王春生;唐耀亮;蔡乃繩;;心包液和血清中bFGF濃度與冠狀動脈側(cè)支循環(huán)的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會心血管病分會第八次全國心血管病學(xué)術(shù)會議匯編[C];2004年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心 李校X 姚成燦;bFGF肌膚“裝修”揭秘[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

2 暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心 李校坤博士;第二個基因工程一類新藥[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

3 SFDA南方所時每醫(yī)藥信息有限公司 宗云崗;一類新藥市場通道遭遇障礙[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2004年

4 王瑋琴；周惠君;中藥在腫瘤血管抑制中的作用[N];中國醫(yī)藥報;2004年

5 ;胎兒和少兒皮膚內(nèi)堿性成纖維細胞生長因子及其受體的基因表達[N];中國醫(yī)藥報;2003年

6 小申;新武器對付眼表病[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

7 本報記者 李雪墨 陳國東;新星璀璨耀津城[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

8 張岫美 吳葆杰;與“第一殺手”過招[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2002年

9 全國政協(xié)委員、中華茂祥（集團）有限公司董事局主席 王茂祥;寧可吃虧 也要參與國企改革[N];人民政協(xié)報;2003年

10 ;單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂誘導(dǎo)成年大鼠骨髓基質(zhì)細胞成為神經(jīng)前體細胞及其分化作用的研究[N];中國醫(yī)藥報;2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李丹;bFGF單抗抗血管新生及抗腫瘤作用研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

2 王少云;轉(zhuǎn)染bFGF的骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合SIS構(gòu)建組織工程皮膚治療兔2型糖尿病早期皮膚缺損的實驗研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2010年

3 李元城;微流控芯片上胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）對兔關(guān)節(jié)軟骨細胞體外增殖的影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2010年

4 黃世威;bFGF和CTLA4-Ig基因修飾的RPE細胞建立及其表達特性研究[D];吉林大學(xué);2011年

5 王凱;腺病毒載體介導(dǎo)靶向bFGF的RNAi對體外培養(yǎng)前列腺間質(zhì)細胞bFGF表達及其增殖和凋亡的影響[D];中國醫(yī)科大學(xué);2009年

6 張光偉;肝素化bFGF支架在心肌損傷修復(fù)中的實驗研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2010年

7 王建華;bFGF/雙層膠原基復(fù)合材料修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損及其相關(guān)研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

8 谷慶陽;bFGF對輻射誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡的調(diào)控作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2003年

9 馬雷;bFGF基因修飾的MSCs細胞復(fù)合β-磷酸三鈣修復(fù)骨缺損實驗研究[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2010年

10 劉穎;內(nèi)源性bFGF在缺血性腦組織中的表達和調(diào)控及外源性bFGF的應(yīng)用時間窗口和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 劉雨;絲素材料裝載堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）后的促細胞生長作用[D];蘇州大學(xué);2010年

2 楊帆;bFGF和μPA蛋白在鼻咽癌組織中的表達及臨床意義[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2011年

3 許爾長;重組水蛭素誘導(dǎo)bFGF表達，促進靜脈淤血皮瓣存活的實驗研究[D];瀘州醫(yī)學(xué)院;2011年

4 湯琪樂;Syndecan-1，，bFGF在大腸癌中的表達及臨床意義[D];浙江大學(xué);2003年

5 聞公靈;bFGF對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究[D];鄭州大學(xué);2004年

6 張靜;bFGF、SCF誘導(dǎo)人臍血CD34~+、CD133~+細胞基因表達變化的研究[D];鄭州大學(xué);2010年

7 李宜航;西洋參莖葉皂苷對大鼠缺血腦組織IL-6和bFGF含量的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2010年

8 龐文筠;bFGF影響體外培養(yǎng)的不同分化階段成骨細胞活性及凋亡的實驗研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2003年

9 王新武;人bFGF重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2010年

10 李文冬;DDR1、bFGF在腎小管間質(zhì)纖維化大鼠腎組織的表達及金雀異黃素的干預(yù)作用[D];蘭州大學(xué);2011年

本文編號：1441096