本文關(guān)鍵詞：超順磁氧化鐵納米粒介導(dǎo)bFGF轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞　出處：《蘇州大學(xué)》2011年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 超順磁氧化鐵納米粒子 pEGFP-C1 bFGF 基因轉(zhuǎn)染

【摘要】：目的 用經(jīng)過(guò)多聚賴(lài)氨酸修飾的超順磁氧化鐵納米粒子作為基因載體,將攜帶堿性成纖維生長(zhǎng)因子的綠色熒光蛋白質(zhì)粒pEGFP-C1-bFGF轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞,并初步研究其轉(zhuǎn)染效果,探討超順磁氧化鐵納米粒子作為一種新型基因載體進(jìn)行體外角膜內(nèi)皮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的可行性。 本實(shí)驗(yàn)分兩部分: 第一部分:貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定。 第二部分:超順磁氧化鐵納米粒介導(dǎo)pEGFP-C1-bFGF基因轉(zhuǎn)染貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞及其表達(dá)的觀(guān)察。 方法 第一部分:無(wú)菌條件下取貓齡小于3個(gè)月的貓眼球,沿角膜緣剪開(kāi)取角膜片,按揭取后彈力層培養(yǎng)法進(jìn)行角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀(guān)察不同階段培養(yǎng)的細(xì)胞的形態(tài),用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)各代活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。并用NSE抗體對(duì)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定,觀(guān)察傳代細(xì)胞是否保持有角膜內(nèi)皮細(xì)胞的特性。 第二部分:用多聚賴(lài)氨酸為修飾物,使多聚賴(lài)氨酸通過(guò)靜電作用結(jié)合于超順磁氧化鐵納米粒子表面,獲得多聚賴(lài)氨酸-超順磁氧化鐵納米粒子復(fù)合物(SPIONs—PLL)。借助含有報(bào)告基因的真核表達(dá)載體pEGFP-C1,用SPIONs—PLL作為基因載體,將bFGF基因轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞。在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率,并繼續(xù)觀(guān)察bFGF基因表達(dá)情況。 結(jié)果 第一部分:體外成功培養(yǎng)原代貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞,并傳到第4代。其中原代與1代細(xì)胞生長(zhǎng)良好,細(xì)胞呈鋪路石樣向周邊鋪展擴(kuò)增,大部細(xì)胞形態(tài)呈規(guī)則多邊形、生長(zhǎng)狀態(tài)好,活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)分別為99.8%,99.1%。而從2代開(kāi)始的角膜內(nèi)皮細(xì)胞貼壁和增殖能力開(kāi)始減弱,傳至3代細(xì)胞形態(tài)變大不規(guī)則、胞質(zhì)內(nèi)空泡漸增多,細(xì)胞數(shù)量漸少,活細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)分別為98.2%,94.3%,91.3%。傳代培養(yǎng)的貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞用NSE鑒定,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)抗體NSE的陽(yáng)性表達(dá)。 第二部分:獲得密度均勻的SPIONs—PLL懸浮溶液。由于SPIONs—PLL在中性溶液中帶正電,顆粒彼此間存在靜電斥力,可以抵消部分重力作用,所以SPIONs—PLL在久置后仍處于懸浮狀態(tài)。并且成功將pEGFP-C1-bFGF基因轉(zhuǎn)染入貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞,48 h后熒光顯微鏡下可見(jiàn)特異性的綠色熒光,未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未見(jiàn)綠色熒光,轉(zhuǎn)染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞均生長(zhǎng)良好。經(jīng)western blot檢測(cè),證明轉(zhuǎn)染攜帶有bFGF基因質(zhì)粒的細(xì)胞中bFGF基因表達(dá)顯著增高。 結(jié)論 1、體外利用揭取后彈力層法能夠成功培養(yǎng)出角膜內(nèi)皮細(xì)胞并傳代,隨著細(xì)胞的傳代細(xì)胞增殖能力減弱,繼續(xù)傳代能力差。傳代細(xì)胞經(jīng)NSE鑒定呈陽(yáng)性表達(dá),證明本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞為神經(jīng)嵴來(lái)源的細(xì)胞。 2、經(jīng)多聚賴(lài)氨酸修飾的超順磁氧化鐵納米粒子可作為基因載體將pEGFP-C1-bFGF基因轉(zhuǎn)染入貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞并得到表達(dá),轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)良好。且超順磁氧化鐵納米粒子所具有的超順磁性可達(dá)到在外加磁場(chǎng)條件下提高轉(zhuǎn)染效率的效果。說(shuō)明超順磁氧化鐵納米粒子可作為一種新型基因載體在基因工程細(xì)胞轉(zhuǎn)染方面具有較大的可行性。
[Abstract]:objective
After using poly-L-lysine modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles as gene carrier, will carry the basic culture of fibroblast growth factor GFP plasmid pEGFP-C1-bFGF was transfected into in vitro cat corneal endothelial cells, and to study the effect of transfection, superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a novel gene vector for gene in vitro cornea the feasibility of transfection of endothelial cells.
The experiment is divided into two parts:
Part 1: culture and identification of corneal endothelial cells in cat's cornea.
The second part: Ultraparamagnetic iron oxide nanoparticles mediated pEGFP-C1-bFGF gene transfection in cat corneal endothelial cells and their expression.
Method
The first part: sterilely cat age less than 3 months of the cat eye, along the limbus cornea cut to take the mortgage, Descemet culture method of corneal endothelial cells and cultured in different stages. Observe the morphology of cultured cells under the inverted microscope, the percentage of each generation counting with trypan. Cell blue staining. And NSE antibody on cultured cells were identified and observed whether cell maintain characteristics of corneal endothelial cells.
The second part: the use of poly lysine as modifier, the poly lysine by electrostatic interaction combined with superparamagnetic iron oxide nanoparticles, obtain polylysine superparamagnetic iron oxide nanoparticle composites (SPIONs - PLL). The eukaryotic expression vector pEGFP-C1 containing reporter gene, SPIONs PLL as gene vector, bFGF gene was transfected into in vitro cultured cat corneal endothelial cells. The transfection efficiency was observed under the inverted fluorescence microscope, and to observe the expression of bFGF gene.
Result
The first part: the primary cultured cat corneal endothelial cells were cultured successfully, and spread to the fourth generation. One original and 1 generation cells grew well, cells showed cobblestone amplification to the surrounding spreading of the cells showed irregular polygons, growth state, percentage of living cells was 99.8% 99.1%., and from the beginning of the 2 generation the corneal endothelial cell adherence and proliferation ability began to weaken, spread to the 3 generation cells became larger and irregular, cytoplasmic vacuoles gradually increased, the number of cells gradually less, percentage of living cells were 98.2%, 94.3%, 91.3%. were cultured cat corneal endothelial cells were identified by NSE, the positive expression of NSE cell antibody in the matter.
The second part: SPIONs PLL suspended solution density uniform. Because the SPIONs - PLL in neutral solution are positively charged, electrostatic repulsion between particles, can be partially offset the effect of gravity, so SPIONs PLL in long after the suspension is still in the state. And the success of the pEGFP-C1-bFGF gene was transfected into cat corneal endothelial cells, 48 h under the fluorescence microscope after visible specific green fluorescence, the green fluorescence of untransfected cells were transfected cells and untransfected cells were growing well. By Western blot assay, the expression of bFGF that transfected with bFGF gene plasmid genes was significantly increased.
conclusion
1, in vitro by stripping Descemet method successfully cultured corneal endothelial cells proliferation and passage, with the reduced ability of cell to cell, passage ability. Cells were identified by NSE positive expression, prove the cultured corneal endothelial cells from neural crest cells.
2, the poly lysine modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles can be used as a gene vector pEGFP-C1-bFGF gene transfection in cat corneal endothelial cells and expression of transfected cells grew well. And super paramagnetic iron oxide superparamagnetic nanoparticles can improve transfection efficiency in the presence of an external magnetic field effect. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles can be used as a new gene carrier has great feasibility in gene engineering cell transfection.

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R77

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本文編號(hào)：1441096