本文關(guān)鍵詞：抗TNF-α和IL-1βIgY抗體治療豚鼠過敏性鼻炎的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《南昌大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的： 探討抗TNF-α及IL-1β IgY滴鼻治療過敏性鼻炎及改善肺組織炎癥的作用及其機(jī)制。 方法： 1、IgY抗體制備 2、應(yīng)用卵清蛋白腹腔注射致敏、滴鼻攻擊方法建立豚鼠過敏性鼻炎模型。 3、采用卵清蛋白皮內(nèi)注射方法鑒定豚鼠過敏性鼻炎模型。 4、豚鼠隨機(jī)分為正常對照組（C組），過敏性鼻炎模型組（M組），非特異性IgY治療組（Z1組），0.1%抗TNF-α IgY治療組（Z2組），0.1%抗IL-1βIgY治療組（Z3組），0.1%抗TNF-α和IL-1β IgY治療組（Z4組），丙酸氟替卡松治療組（Z5組）。每組治療結(jié)束后在2h、4h、8h等三個時間點(diǎn)觀察結(jié)果。 5、C組（生理鹽水滴鼻攻擊）、M組、Z1組、Z2組、Z3組、Z4組、Z5組每次OVA滴鼻攻擊和治療時滴入IgY或生理鹽水后再滴入OVA滴鼻攻擊后30min內(nèi)通過肉眼觀察對豚鼠的癥狀（打噴嚏、抓鼻、流涕量）表現(xiàn)，并進(jìn)行記錄和評分。 6、各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束日末次治療和OVA激發(fā)后在2h、4h、8h腹腔注射10%水合氯醛麻醉豚鼠，使用PBS緩沖液滴注豚鼠鼻腔進(jìn)行鼻灌洗，并抽取鼻灌洗液（NLF），離心，取上清和沉淀細(xì)胞。 7、各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束日末次治療和OVA激發(fā)后在2h、4h、8h腹腔注射10%水合氯醛麻醉豚鼠，采用心臟穿刺法抽取血液，抗凝，血涂片，離心取血漿。 8、各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束日末次治療和OVA激發(fā)后在2h、4h、8h處死豚鼠，對右肺采用PBS緩沖液進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，抽取支氣管肺泡灌洗液（BALF）離心取沉淀細(xì)胞。 9、各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束日末次治療和OVA激發(fā)后在2h、4h、8h處死豚鼠，分離鼻黏膜組織及左肺、4%多聚甲醛固定組織、石蠟包埋固定的組織、組織切片等，進(jìn)行病理檢查。 10、采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定各組血漿、鼻灌洗液(NLF)中TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-18、IL-22、IL-33、TGF-β等炎癥細(xì)胞因子和Th2細(xì)胞因子，以及OVA特異性IgE含量。 11、采用Wright's染色法對血液、鼻灌洗液（NLF）、支氣管肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞涂片進(jìn)行染色，計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞數(shù)量。 12、采用HE染色法對鼻黏膜組織和肺組織切片進(jìn)行染色，觀察組織病理學(xué)變化以及組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，并計(jì)數(shù)組織嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量。 13、采用免疫組織化學(xué)染色法對鼻黏膜組織和肺組織切片進(jìn)行TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-33染色，觀察組織細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-33的表達(dá)量的變化。 14、采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1、經(jīng)卵清蛋白腹腔注射致敏、滴鼻攻擊建立Hartley豚鼠過敏性鼻炎模型的成功率為96.63%（172只/178只），豚鼠死亡率69.85%（183只/262只）。 2、與M組比較，Z2組、Z3組、Z4組、Z5豚鼠OVA激發(fā)30min內(nèi)其過敏癥狀明顯減輕，抓鼻次數(shù)、打噴嚏數(shù)、以及流涕量逐漸減少（P0.05）；而C組豚鼠滴鼻生理鹽水時偶見輕度抓鼻，未見打噴嚏和流鼻涕癥狀。 3、鼻粘膜：正常對照組（C組）鼻粘膜固有層偶見淋巴細(xì)胞浸潤；0.1%抗TNF-α和IL-1β IgY治療組（Z4組）和丙酸氟替卡松治療組（Z5組）在嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，粘膜層水腫，粘膜上皮細(xì)胞完整性等方面明顯輕于模型組（M組）和非特異性IgY治療組（Z1組），同時也輕于0.1%抗TNF-α IgY治療組（Z2組）和0.1%抗IL-1β IgY治療組（Z3組），尤其是在8h。 肺組織：正常對照組（C組）粘膜下層偶見淋巴細(xì)胞浸潤；0.1%抗TNF-α和IL-1β IgY治療組（Z4組）和丙酸氟替卡松治療組（Z5組）在嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，支氣管粘膜細(xì)胞脫落，肺間質(zhì)水腫，肺泡管結(jié)構(gòu)受損，肺間隔增厚和斷裂，管壁平滑肌增厚等方面明顯輕于模型組（M組）和非特異性IgY治療組（Z1組），同時也輕于0.1%抗TNF-α IgY治療組（Z2組）和0.1%抗IL-1β IgY治療組（Z3組），尤其是在8h。 4、在2h、4h、8h時間點(diǎn)豚鼠鼻粘膜和肺組織中，嗜酸性粒細(xì)胞百分率在C組Z5Z4Z3Z2Z1和M組等依次減少；其中Z4和Z5組顯著低于M和Z1組（P0.05）。 5、在鼻粘膜IL-1β、TNF-α、IL-5和IL-33的表達(dá)主要位于鼻粘膜上皮細(xì)胞和固有層的腺體細(xì)胞內(nèi)，而在肺組織IL-1β、TNF-α、IL-5和IL-33的表達(dá)主要位于肺泡和肺泡隔腺體細(xì)胞和支氣管粘膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)，其中IL-1β、IL-33在Z4組和Z5組表達(dá)量較M組、Z1組、Z2組和Z3組明顯降低，而M組與Z1組、以及Z4組與Z5組的表達(dá)量無明顯差異。 6、在外周血中2h的Z2、Z3、Z5組，8h的Z4組，嗜酸性粒細(xì)胞顯著低于M組（P0.05）。 在鼻灌洗液中2h、4h、8h的Z2、Z3、Z4、Z5組嗜酸性粒細(xì)胞顯著低于M組和Z1組（P0.05）；在2h的Z5組，在4h的Z3、Z4、Z5組，在8h的Z3、Z5組，嗜中性粒細(xì)胞顯著低于M組（P0.05）；在2h的Z4和Z5組，4h的Z4組，8h的Z3和Z5組，淋巴細(xì)胞顯著低于M組（P0.05）。 在支氣管肺灌洗液中2h的Z2、Z3、Z4、Z5組，4h和8h的Z3、Z4、Z5組嗜酸性粒細(xì)胞顯著低于M組（P0.05）；在2h的Z2、Z3、Z4組，Z5組，，8h的Z4組，嗜中性粒細(xì)胞顯著低于M組（P0.05）；在2h的Z1、Z3、Z4、Z5組，4h的Z3和Z5組，8h的Z5組，淋巴細(xì)胞顯著低于M組（P0.05）。 7、在鼻灌洗液中2h時，Z2、Z3、Z4、Z5組IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-9、IL-33等炎癥細(xì)胞因子和OVA特異性IgE抗體的含量顯著低于模型組（M組）和非特異性IgY治療組（Z1組）；IL-13的含量在Z3、Z4、Z5組顯著低于M組、Z1和Z2組； IL-18、TGF-β和IL-22的含量在Z2、Z3、Z4、Z5組顯著低于M組（P0.05）。4h時，Z2、Z3、Z4、Z5組IL-1β、IL-5、IL-9、IL-33等炎癥細(xì)胞因子和OVA特異性IgE抗體的含量顯著低于模型組（M組）和非特異性IgY治療組（Z1組）；IL-13的含量在Z3、Z4、Z5組顯著低于M組和Z2組；TNF-α的含量在Z2、Z3、Z4、Z5組顯著低于M組；TGF-β的含量在Z3、Z4、Z5組顯著低于M組；IL-22的含量在Z4組和Z5組顯著低于M組（P0.05）。8h時，Z2、Z3、Z4、Z5組IL-1β、IL-5、IL-9、TNF-α、IL-33的含量，Z3、Z4、Z5組IL-13和IL-22的含量，Z2、Z4、Z5組TGF-β的含量，Z4組OVA特異性IgE抗體的含量顯著低于模型組（M組）（P0.05）；Z2、Z3、Z4、Z5組IgE、IL-1β、IL-9、IL-22、TGF-β的含量，Z3、Z4、Z5組IL-5、IL-33、TNF-α的含量，Z5組IL-13的含量顯著低于非特異性IgY治療組（Z1組）（P0.05）。 8、在血漿中2h時，Z2、Z3、Z4、Z5組TNF-α、IL-13、TGF-β、IL-33等炎癥細(xì)胞因子和OVA特異性IgE抗體的含量顯著低于模型組（M組）和非特異性IgY治療組（Z1組）（P0.05）；Z2、Z3、Z4、Z5組IL-5、IL-9的含量，Z1組IL-9、IL-13、TNF-α的含量，Z3、Z4、Z5組IL-18的含量，以及Z4和Z5組IL-1β的含量顯著低于模型組（M組）（P0.05）；Z3、Z4、Z5組IL-5，Z4組IL-9，Z3和Z4組IL-18，以及Z4和Z5組IL-1β、IL-22等炎癥細(xì)胞因子的含量顯著低于非特異性IgY治療組（Z1組）（P0.05）。4h時，Z2、Z3、Z4、Z5組IL-5、IL-18、TGF-β、IL-22、IL-33等炎癥細(xì)胞因子的含量顯著低于模型組（M組）和非特異性IgY治療組（Z1組）（P0.05）；Z1、Z2、Z3、Z4、Z5組的IL-13，Z2、Z3、Z4、Z5組的OVA特異性IgE，Z3、Z4、Z5組的IL-1β、IL-9，Z4組的TNF-α等炎癥細(xì)胞因子含量顯著低于模型組（M組）（P0.05）；Z2、Z4、Z5組的OVA特異性IgE，Z3、Z4、Z5組的IL-9，Z3和Z5組的IL-13，Z4和Z5組的IL-1β，Z4組的TNF-α等炎癥細(xì)胞因子含量顯著低于非特異性IgY治療組（Z1組）（P0.05）。8h時， Z2、Z3、Z4、Z5組IL-5、TGF-β、IL-33等炎癥細(xì)胞因子的含量顯著低于模型組（M組）和非特異性IgY治療組（Z1組）（P0.05）；Z5組的OVA特異性IgE抗體，Z4和Z5組的IL-1β、IL-9，Z1、Z2、Z3、Z4組的IL-13，Z4組的IL-18，Z2和Z5組的TNF-α，以及Z1、Z2、Z3、Z4、Z5組的IL-22等炎癥細(xì)胞因子含量顯著低于模型組（M組）（P0.05）；Z5組的OVA特異性IgE抗體，Z4和Z5組的IL-9， Z2、Z3、Z4、Z5組的TNF-α、IL-18，以及Z2組的IL-22等炎癥細(xì)胞因子含量顯著低于非特異性IgY治療組（Z1組）（P0.05）。 9、在血漿中炎癥細(xì)胞因子TNF-α與IL-1β （r=0.623，P0.01）、IL-5（r=0.676，P0.01）、IgE（r=0.703，P0.01）、IL-9（r=0.634，P0.01）、IL-13（r=0.541，P0.01）、IL-18（r=0.703，P0.01）、TGF-β（r=0.779，P0.01）、IL-22（r=0.324，P0.01）、IL-33（r=0.723，P0.01），以及IL-1β與IL-5（r=0.677，P0.01）、IgE（r=0.723，P0.01）、IL-9（r=0.745，P0.01）、IL-13（r=0.576，P0.01）、IL-18（r=0.558，P0.01）、TGF-β（r=0.728，P0.01）、IL-22（r=0.515，P0.01）、IL-33（r=0.750，P0.01）等炎癥細(xì)胞因子的含量呈正相關(guān)。 在鼻灌洗液中炎癥細(xì)胞因子TNF-α與IL-1β（r=0.761，P0.01）、IL-5（r=0.619，P0.01）、IgE（r=0.657，P0.01）、IL-9（r=0.736，P0.01）、IL-13（r=0.549，P0.01）、TGF-β（r=0.625，P0.01）、IL-22（r=0.704，P0.01）、IL-33（r=0.691，P0.01），以及IL-1β與TNF-α（r=0.761，P0.01）、IL-5（r=0.754，P0.01）、IgE（r=0.821，P0.01）、IL-9（r=0.877，P0.01）、IL-13（r=0.583，P0.01）、IL-18（r=0.402，P0.01）、TGF-β（r=0.721，P0.01）、IL-22（r=0.719，P0.01）、IL-33（r=0.779，P0.01）等炎癥細(xì)胞因子的含量呈正相關(guān)。 結(jié)論： 1、采用卵清蛋白（OVA）和氫氧化鋁凝膠腹腔注射基礎(chǔ)免疫，及OVA滴鼻加強(qiáng)免疫（攻擊或激發(fā)）豚鼠成功地建立了穩(wěn)定的過敏性鼻炎豚鼠模型。 2、抗TNF-α和IL-1β IgY抗體滴鼻局部治療過敏性鼻炎模型豚鼠能夠有效地抑制由OVA誘導(dǎo)的過敏性鼻炎豚鼠鼻粘膜和肺組織過敏性炎癥病理反應(yīng)的發(fā)展，并減輕過敏性炎癥病理反應(yīng)程度。 3、抗TNF-α和IL-1β IgY抗體治療豚鼠過敏性鼻炎的作用機(jī)制可能是通過抑制嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的增加和浸潤，減少IL-1β、TNF-α、TGF-β1、IL-5、IL-9、IL-13、IL-22、IL-33等原炎癥因子和Th2細(xì)胞因子，以及OVA特異性IgE抗體的水平而發(fā)揮作用。 4、卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的過敏性鼻炎模型豚鼠并發(fā)過敏性哮喘的癥狀和過敏性炎癥病理改變，充分證明上下呼吸道過敏性炎癥的同步性、一致性，同時也證明治療的一致性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R765.21


本文編號：1399265