本文關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)小鼠多能干細(xì)胞分化為角膜上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：探討鼠源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(mice induced pluripotent stem cells，miPSCs）通過(guò)與小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)途徑誘導(dǎo)分化為角膜上皮的可行性，檢測(cè)miPSCs向角膜上皮細(xì)胞分化后形態(tài)學(xué)變化以及部分標(biāo)志蛋白表達(dá)的變化，為研究miPSCs向角膜上皮的分化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：購(gòu)買小鼠ips細(xì)胞株和輻射后小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株（mouse embryonicfibroblast MEF），使用飼養(yǎng)層細(xì)胞法培養(yǎng)擴(kuò)增小鼠來(lái)源ips細(xì)胞。應(yīng)用Western blotting法檢測(cè)誘導(dǎo)分化前鼠源ips細(xì)胞多能性標(biāo)志性蛋白Oct4、Nanog和Sox2的表達(dá)以進(jìn)行鑒定。體外分離，增殖小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞。將鼠源iPSCs在體外環(huán)境與小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)以誘導(dǎo)分化。應(yīng)用倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)分化1周后miPSCs的形態(tài)學(xué)變化，并應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)miPSCs分化后角膜上皮標(biāo)志蛋白K12的表達(dá)變化，RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞分化后K12的mRNA表達(dá)。 結(jié)果：培養(yǎng)的miPSCs復(fù)蘇3天后在倒置顯微鏡下觀察呈克隆樣生長(zhǎng)，，克隆呈圓形或橢圓形，邊界清楚�？寺�(nèi)細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞體積小，核大，核仁清晰，細(xì)胞核/質(zhì)比高。應(yīng)用Western blotting對(duì)其miPSCs進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示細(xì)胞均表達(dá)多能性標(biāo)志性蛋白Oct4、Nanog和Sox2；分化后細(xì)胞呈多角形，胞體發(fā)暗，排列疏松，細(xì)胞核/質(zhì)比變小。免疫熒光法檢測(cè)分化前miPSCs的K12均未見(jiàn)表達(dá)，miPSCs經(jīng)1周的誘導(dǎo)分化后其細(xì)胞均表達(dá)角膜上皮標(biāo)志蛋白K12。 結(jié)論：使用飼養(yǎng)層細(xì)胞法擴(kuò)增小鼠來(lái)源ips細(xì)胞能夠使其在擴(kuò)增數(shù)代后仍然保留有多向分化潛能而不分化。在體外與小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，能夠?qū)⑹笤磇PSCs細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化成為角膜上皮樣細(xì)胞，使miPSCs不僅從形態(tài)學(xué)上向角膜上皮分化，同時(shí)成功表達(dá)角膜上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白K12。
[Abstract]:Objective: to study induced pluripotent stem cells in mice induced by murine pluripotent stem cells. The feasibility of inducing differentiation into corneal epithelium by co-culture with mouse corneal stromal cells (miPSCs). The morphological changes and the expression of some marker proteins after the differentiation of miPSCs into corneal epithelial cells were detected to provide experimental basis for studying the differentiation of miPSCs into corneal epithelium. Methods: the mouse ips cell line and the irradiated mouse embryonicfibroblast MEF cell line were purchased. Murine ips cells were cultured and amplified by feeder layer cell culture and Western blotting method was used to detect the multipotent marker protein Oct4 of mouse ips cells before induction of differentiation. Expression of Nanog and Sox2 for identification. Isolated in vitro. Mouse corneal stromal cells were proliferated. Mouse iPSCs was co-cultured with mouse corneal stromal cells in vitro to induce differentiation. The morphological changes of miPSCs after 1 week of differentiation were observed by inverted microscope. . The expression of corneal epithelial marker protein K12 after miPSCs differentiation was detected by immunofluorescence assay. The mRNA expression of K12 was detected by RT-PCR. Results: after 3 days of resuscitation, the cultured miPSCs were observed to grow like clones under inverted microscope, the clones were round or elliptical, the boundaries were clear, the cells in the clones were arranged tightly, the cells were small and the nuclei were large. The nucleoli were clear and the ratio of nucleus to cytoplasm was high. The miPSCs was identified by Western blotting. The results showed that all cells expressed multipotent iconic protein Oct4. Nanog and Sox2; After differentiation, the cells showed polygonal shape, dark cell body, loose arrangement and smaller nuclear / cytoplasm ratio. No expression of K12 in miPSCs was detected by immunofluorescence. MiPSCs cells expressed corneal epithelial marker protein K12 after 1 week of differentiation. Conclusion: using feeder layer cell method to amplify murine ips cells can keep the ability of differentiation without differentiation and co-culture with mouse corneal stromal cells in vitro. Mouse iPSCs cells could be induced to differentiate into corneal epithelioid cells, and miPSCs not only differentiated into corneal epithelium morphologically, but also successfully expressed the corneal epithelial marker protein K12.
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R772.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1366276