本文關(guān)鍵詞：木黃銅誘導(dǎo)人喉癌細(xì)胞系Hep-2凋亡及抑制其增殖的研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：喉癌是全人類(lèi)第11種常見(jiàn)的惡性腫瘤，主要來(lái)源喉部粘膜上皮組織。喉癌在病理組織學(xué)上，絕大部分為鱗狀上皮細(xì)胞。治療喉癌的傳統(tǒng)方法主要是手術(shù)，放療或輔助治療。雖然手術(shù)切除病灶是治療喉癌的直接手段，但術(shù)后要面對(duì)局部腫瘤高復(fù)發(fā)率的風(fēng)險(xiǎn)或是因發(fā)音和吞咽功能障礙所帶來(lái)的較差的生活質(zhì)量。尋求一種可以使腫瘤縮小，減小切除范圍，降低復(fù)發(fā)率及提高患者生活質(zhì)量和生存率的新化療輔助藥物顯得日益重要。細(xì)胞凋亡也稱(chēng)細(xì)胞程序性死亡，其過(guò)程是由大量相關(guān)因子和信號(hào)通路共同參與，并嚴(yán)格調(diào)控的，是確保機(jī)體穩(wěn)態(tài)，維持組織和器官形態(tài)正常必不可少的條件。異常的調(diào)亡途徑常常會(huì)引起人類(lèi)各種疾病，其中包括腫瘤。逃脫細(xì)胞凋亡不僅是腫瘤的常見(jiàn)特征也是腫瘤對(duì)化療藥物形成抵抗的形成原因。因此，那些可以通過(guò)阻斷或抑制細(xì)胞增殖引起細(xì)胞凋亡的藥物極有可能成為抗腫瘤藥物。木黃酮（Genistein），化學(xué)名為4、5、7-三羥基異黃酮，是從廣泛存在自然界的豆科植物中發(fā)現(xiàn)的一種具有天然生物活性的黃酮類(lèi)化合物。攝入木黃酮后對(duì)機(jī)體除了產(chǎn)生以抗腫瘤為主的重要生物效應(yīng)以外，還具有抑制骨質(zhì)疏松形成、預(yù)防心血管疾病發(fā)生及減少絕經(jīng)后不良反應(yīng)等多種衛(wèi)生保健作用。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)木黃酮在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用。它的主要抗腫瘤機(jī)制為：1.調(diào)控細(xì)胞周期：經(jīng)木黃酮處理后，大部分腫瘤細(xì)胞能夠出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯，可能與木黃酮可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白（cyclin B）、CDKIs （p21WAF1）在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量有關(guān)。2.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：用各種標(biāo)志性檢測(cè)細(xì)胞凋亡的技術(shù)方法，可以觀(guān)察到經(jīng)木黃酮干預(yù)后的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡， caspase-3的激活， Bcl-2、Bcl-xL表達(dá)量下降及Bax高表達(dá)等為其主要分子機(jī)制。3.調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移：木黃酮可以從抑制FAK的磷酸化，選擇性抑制MMPs，抑制TGF-β信號(hào)途徑等多種途徑，影響細(xì)胞粘附、遷移及侵襲。4.作為植物性雌激素：因?yàn)橛兄c17-β-雌二醇相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其具有部分雌激素作用，可以與雌激素受體結(jié)合，近而影響性激素介導(dǎo)的腫瘤的生長(zhǎng)（乳腺癌、前列腺癌等）。5.其他：影響VEGF的表達(dá)，抗血管形成；清除自由基，減少或防止活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷，實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。本實(shí)驗(yàn)旨在以人喉癌細(xì)胞系Hep-2為研究對(duì)象，通過(guò)倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、CCK-8試劑盒、流式細(xì)胞術(shù)等方法和技術(shù)觀(guān)察木黃酮對(duì)人類(lèi)喉癌細(xì)胞系Hep-2抑制細(xì)胞周期和增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，從而為木黃酮應(yīng)用于臨床中喉部腫瘤的治療提供一些實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。 方法： 1在體外適宜條件下培養(yǎng)人喉癌細(xì)胞系Hep-2，并給予不同濃度的木黃酮進(jìn)行干預(yù)。 2通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)木黃酮對(duì)喉癌細(xì)胞增殖的抑制程度。 3分別在倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡下觀(guān)察經(jīng)木黃酮干預(yù)后細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及生長(zhǎng)情況等方面的變化。 4應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)木黃酮對(duì)細(xì)胞周期各時(shí)相分布的影響和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。 5應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)木黃酮引起人喉癌細(xì)胞系Hep-2中Bcl-2mRNA、Survivin mRNA表達(dá)量的改變。 6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析和統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x+s)表示。比較兩樣本均數(shù)選擇t檢驗(yàn)。用單因素方差分析進(jìn)行多樣本均數(shù)間的比較，若有顯著性差異，接著用LSD法進(jìn)行兩兩比較。所有比較結(jié)果，當(dāng)Ｐ㩳0.05時(shí)則可認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：倒置相差顯微鏡下觀(guān)察喉癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：空白對(duì)照組中的Hep-2細(xì)胞飽滿(mǎn)，細(xì)胞形態(tài)輪廓清晰，呈梭形、多邊形、上皮細(xì)胞樣，良好的貼壁生長(zhǎng)，在培養(yǎng)液中未見(jiàn)明顯懸浮細(xì)胞。給予木黃酮干預(yù)的細(xì)胞胞漿濃縮，邊緣不規(guī)則，可見(jiàn)部分細(xì)胞表面有出芽現(xiàn)象，一些溶解破碎細(xì)胞及脫落的懸浮細(xì)胞。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明木黃酮可以明顯抑制喉癌細(xì)胞的增殖，隨著藥物濃度的增加，其抑制率不斷上升，，有顯著的劑量依賴(lài)關(guān)系。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明：木黃酮可以引起細(xì)胞G2期阻滯，當(dāng)藥物濃度增加時(shí)會(huì)出現(xiàn)S期阻滯，并伴隨著G1期細(xì)胞比例的下降。喉癌細(xì)胞經(jīng)12μg/ml木黃酮干預(yù)24小時(shí)后，其G2期及S期的細(xì)胞累積量明顯增多，分別與對(duì)照組相比較，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ㩳0.05）。不僅如此，木黃酮還能誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而且隨著藥物濃度增加和作用時(shí)間的累積，凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸上升，呈明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)關(guān)系。相同作用時(shí)間，不同濃度木黃酮作用于喉癌細(xì)胞后所誘導(dǎo)的凋亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ㩳0.05），相同濃度的木黃酮分不同時(shí)間長(zhǎng)度作用喉癌細(xì)胞后，其出現(xiàn)的凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ㩳0.05）。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以檢測(cè)到：Bcl-2mRNA、Survivin mRNA在經(jīng)過(guò)木黃酮處理后的喉癌細(xì)胞中表達(dá)量下降，分別與對(duì)照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ㩳0.05）。 結(jié)論： 1木黃酮能夠?qū)戆┘?xì)胞系Hep-2的增殖具有抑制作用，而且抑制作用呈劑量依賴(lài)效應(yīng)。 2木黃酮可以使喉癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，主要阻滯在G2期；隨著藥物濃度，處于S期的細(xì)胞百分比例也有明顯上升。阻滯細(xì)胞周期可能是木黃酮誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞系Hep-2凋亡的一種作用機(jī)制。 3木黃酮能誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞發(fā)生凋亡呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性，當(dāng)12μg/ml木黃酮作用喉癌細(xì)胞24小時(shí)后細(xì)胞就出現(xiàn)較多凋亡，隨劑量和時(shí)間增加，凋亡率不斷增高。 4木黃酮降低了喉癌細(xì)胞Bcl-2、Survivin的表達(dá)量。
[Abstract]:Objective: laryngeal carcinoma is the eleventh common malignant tumor of all human beings, mainly from the mucous epithelium of the larynx. Most of the carcinoma of the larynx is squamous cell in histopathology. The traditional methods for the treatment of larynx cancer are surgery, radiotherapy or adjuvant therapy. Although surgical resection is a direct way to treat laryngeal cancer, postoperative risk of local recurrence or poor quality of life due to dysphagia and dysphagia is the key. It is increasingly important to find a new adjuvant chemotherapy drug that can reduce the tumor size, reduce the extent of resection, reduce the recurrence rate and improve the quality of life and survival rate of patients. Apoptosis, also known as programmed cell death, is involved in the process and regulated strictly by a large number of related factors and signaling pathways. It is essential to ensure homeostasis and maintain normal morphology of tissues and organs. Abnormal apoptosis often causes a variety of human diseases, including tumors. Escape from apoptosis is not only a common feature of cancer, but also the cause of the formation of tumor resistance to chemotherapeutic drugs. Therefore, drugs that can cause cell apoptosis by blocking or inhibiting cell proliferation are extremely likely to become antitumor drugs. Genistein, the chemical name is 4, 5, 7- three hydroxy isoflavones, is a natural activity of Flavonoids from widely occurring natural legumes. After taking flavonoid, the body not only produces important biological effects, but also has many health care functions, such as inhibiting osteoporosis, preventing cardiovascular diseases and reducing postmenopausal adverse reactions. A large number of solid wood flavonoids have obvious inhibitory effects on a variety of tumor cells in vivo and in vivo. The main anti-tumor mechanism of it as follows: 1.: regulation of cell cycle by genistein treatment, most tumor cells can appear obvious G2/M arrest, and Genistein can regulate the cell cycle protein (cyclin B), CDKIs (p21WAF1) is expressed in tumor cells. 2., induce cell apoptosis: we can observe the apoptosis of tumor cells after Huang Tonggan's prognosis, the activation of Caspase-3, the decrease of Bcl-2 and Bcl-xL expression and the high expression of Bax. 3., regulate cell invasion and metastasis: Genistein can inhibit cell adhesion, migration and invasion by inhibiting FAK phosphorylation, selectively inhibiting MMPs and inhibiting TGF- beta signaling pathway. 4., as a phytoestrogen, because it has a similar chemical structure with 17- beta estradiol, it has partial estrogen effect, which can bind to estrogen receptor, and influence the growth of hormone mediated tumor (breast cancer, prostate cancer and so on). 5. other: affecting the expression of VEGF, anti angiogenesis, scavenging free radicals, reducing or preventing the damage of reactive oxygen species to cells, and achieving antioxidant effects. This experiment aimed at human laryngeal cancer cell line Hep-2 as the research object, through the inverted phase contrast microscope, fluorescence microscope, CCK-8 kit and flow cytometry methods and techniques of observation of genistein on human laryngeal carcinoma cell line Hep-2 cell cycle and inhibit proliferation and induce apoptosis in, so as to provide some laboratory data for treatment of genistein applied to the laryngeal tumor in clinic.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1341107