本文關鍵詞：賴氨酸突變對Hsf4b轉錄活性的調控

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【摘要】：背景 先天性白內障是指發(fā)生在出生前后的以晶狀體渾濁為主要臨床癥狀的一類眼疾病，失明兒童中有22-30%為先天性白內障所致�；蜻z傳障礙是導致先天性白內障的主要病因，其中以常染色體顯性遺傳最多。 Hsf4是調控晶狀體早期發(fā)育的關鍵因子，應用基因掃描技術發(fā)現(xiàn)其DNA結合域錯譯突變以及發(fā)生在內含子和外顯子剪接處的終止密碼子突變與人和動物家族遺傳性白內障的發(fā)生密切相關。敲除小鼠Hsf4基因能誘發(fā)新生期小鼠白內障。Hsf4主要參與調控新生期晶狀體上皮細胞的增生和纖維細胞分化。但是，在晶狀體發(fā)育過程中，調控Hsf4轉錄活性的分子機理還不清楚。 Hsf4有Hsf4a和Hsf4b兩種亞型，Hsf4b是調節(jié)小鼠晶狀體發(fā)育的唯一亞型。在晶狀體組織中，Hsf4b參與上調晶狀體熱休克蛋白（Hsp25、β-晶體蛋白和γ-晶體蛋白）和晶狀體細胞骨架蛋白（P49、vimentin和skap2等）的表達，同時下調FGFs家族成員的表達。這說明Hsf4b對其下游靶基因具有轉錄激活和轉錄抑制的雙重作用。其雙重轉錄活性受磷酸化調控，磷酸化S299位點可增加Hsf4b類泛素化，抑制Hsf4b的轉錄活性。我們前期的研究結果顯示磷酸化S299位點可增加Hsf4b與Daxx蛋白結合，Daxx可抑制Hsf4b對下游基因Hsp25的表達調控。此外，我們還發(fā)現(xiàn)調控晶狀體發(fā)育的主要生長因子FGF2參與調控Hsf4b蛋白穩(wěn)定性和轉錄活性。FGF2通過激活ERK1/2誘導Hsf4b磷酸化和類泛素化從而促進Hsf4b的轉錄活性。Hsf4b類泛素化主要發(fā)生在賴氨酸分子上，賴氨酸也是易被其它修飾如乙�；头核鼗陌被�。在Hsf4b分子中含有多個賴氨酸分子。那么，這些賴氨酸分子在晶狀體發(fā)育過程中如何被修飾以及它們調控Hsf4b轉錄活性和蛋白穩(wěn)定性的機理還不清楚。我們應用GPS蛋白類泛素化和乙酰化分析程序對Hsf4b蛋白序列進行預測，發(fā)現(xiàn)有K64、K206、K224、K287、K293、K336、K434位點被修飾的可行性最高。應用定點突變方法對這些位點進行突變，把這些突變體以及野生Hsf4b分別轉入Hsf4-/-小鼠晶狀體上皮細胞內，然后再測定下游Hsp25和alpha B-crystallin蛋白的表達，結果發(fā)現(xiàn)突變后K64G、K206G和K2224G對Hsf4b有抑制作用而K287G、K293G、 K336G和K434G對Hsf4b有激活作用。目前，這些位點調控Hsf4b轉錄活性的機理正在研究中。 目的 選取不同的賴氨酸位點進行突變之后研究能調控Hsf4b轉錄活性的賴氨酸及相關信號通路，為早期診斷和治療與Hsf4b突變相關的先天性白內障提供理論依據(jù)。 方法1.設計并合成七對包含突變位點的引物，分別將Hsf4b上的192bp、618bp、672bp、861bp、879bp、1008bp和1302bp位的AAG/AAA突變成GGC。 2.以pWZL-blast-HA-Hsf4b質粒為模板，用包含突變位點的引物進行擴增，獲得7個突變質粒。 3.測序正確后，將上述質粒轉染進293-phoenix細胞中，用其分泌的含有病毒的上清感染mLEC/Hsf4b-/-細胞，并用藥物Blasticidin進行篩選，獲得持續(xù)且穩(wěn)定表達突變型Hsf4b的細胞株。 4.用Western blot檢測突變后Hsf4b的表達情況，并檢測下游蛋白Hsp25和αB-晶體蛋白的表達差異。 5.通過Luciferase assay實驗，來驗證Hsf4b/K64G和Hsf4b/K293G下游基因αB-晶體蛋白（alpha B-crystallin）的表達差異。 結果 1.成功構建了7個真核表達Hsf4b的突變體質粒。 2.篩選出了持續(xù)且穩(wěn)定表達野生型Hsf4b和突變型Hsf4b的細胞株。 3.突變型Hsf4b蛋白表達量與野生型Hsf4b沒有差異。Hsf4b下游蛋白Hsp25和αB-晶體蛋白在mLEC/HA-Hsf4b/K287G、 mLEC/HA-Hsf4b/K293G，mLEC/HA-Hsf4b/K336G和mLEC/HA-Hsf4b/K434G細胞內的表達明顯高于其在mLEC/HA-Hsf4b細胞內的表達，而在mLEC/HA-Hsf4b/K64G，，mLEC/HA-Hsf4b/K206G和mLEC/HA-Hsf4b/K224G細胞內的表達則明顯低于其在mLEC/HA-Hsf4b細胞內的表達。 4. Luciferase assay實驗初步說明了Hsf4b/K64G能明顯抑制αB-晶體蛋白（alphaB-crystallin）基因啟動子的活性，而Hsf4b/K293G則能激活αB-晶體蛋白（alphaB-crystallin）基因啟動子。 結論 翻譯后修飾賴氨酸對Hsf4b轉錄有不同的的調控活性，其中K64、K206和K224位點對Hsf4b轉錄活性起正調控作用，而K287、K293、K336和K434位點對Hsf4b轉錄活性起負調控作用。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R776.1

【共引文獻】

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本文編號：1288889