本文關(guān)鍵詞：賴氨酸突變對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控

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【摘要】：背景 先天性白內(nèi)障是指發(fā)生在出生前后的以晶狀體渾濁為主要臨床癥狀的一類眼疾病，失明兒童中有22-30%為先天性白內(nèi)障所致。基因遺傳障礙是導(dǎo)致先天性白內(nèi)障的主要病因，其中以常染色體顯性遺傳最多。 Hsf4是調(diào)控晶狀體早期發(fā)育的關(guān)鍵因子，應(yīng)用基因掃描技術(shù)發(fā)現(xiàn)其DNA結(jié)合域錯(cuò)譯突變以及發(fā)生在內(nèi)含子和外顯子剪接處的終止密碼子突變與人和動(dòng)物家族遺傳性白內(nèi)障的發(fā)生密切相關(guān)。敲除小鼠Hsf4基因能誘發(fā)新生期小鼠白內(nèi)障。Hsf4主要參與調(diào)控新生期晶狀體上皮細(xì)胞的增生和纖維細(xì)胞分化。但是，在晶狀體發(fā)育過(guò)程中，調(diào)控Hsf4轉(zhuǎn)錄活性的分子機(jī)理還不清楚。 Hsf4有Hsf4a和Hsf4b兩種亞型，Hsf4b是調(diào)節(jié)小鼠晶狀體發(fā)育的唯一亞型。在晶狀體組織中，Hsf4b參與上調(diào)晶狀體熱休克蛋白（Hsp25、β-晶體蛋白和γ-晶體蛋白）和晶狀體細(xì)胞骨架蛋白（P49、vimentin和skap2等）的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)FGFs家族成員的表達(dá)。這說(shuō)明Hsf4b對(duì)其下游靶基因具有轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制的雙重作用。其雙重轉(zhuǎn)錄活性受磷酸化調(diào)控，磷酸化S299位點(diǎn)可增加Hsf4b類泛素化，抑制Hsf4b的轉(zhuǎn)錄活性。我們前期的研究結(jié)果顯示磷酸化S299位點(diǎn)可增加Hsf4b與Daxx蛋白結(jié)合，Daxx可抑制Hsf4b對(duì)下游基因Hsp25的表達(dá)調(diào)控。此外，我們還發(fā)現(xiàn)調(diào)控晶狀體發(fā)育的主要生長(zhǎng)因子FGF2參與調(diào)控Hsf4b蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。FGF2通過(guò)激活ERK1/2誘導(dǎo)Hsf4b磷酸化和類泛素化從而促進(jìn)Hsf4b的轉(zhuǎn)錄活性。Hsf4b類泛素化主要發(fā)生在賴氨酸分子上，賴氨酸也是易被其它修飾如乙�；头核鼗陌被帷Ｔ贖sf4b分子中含有多個(gè)賴氨酸分子。那么，這些賴氨酸分子在晶狀體發(fā)育過(guò)程中如何被修飾以及它們調(diào)控Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性和蛋白穩(wěn)定性的機(jī)理還不清楚。我們應(yīng)用GPS蛋白類泛素化和乙�；治龀绦�?qū)sf4b蛋白序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有K64、K206、K224、K287、K293、K336、K434位點(diǎn)被修飾的可行性最高。應(yīng)用定點(diǎn)突變方法對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行突變，把這些突變體以及野生Hsf4b分別轉(zhuǎn)入Hsf4-/-小鼠晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)，然后再測(cè)定下游Hsp25和alpha B-crystallin蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變后K64G、K206G和K2224G對(duì)Hsf4b有抑制作用而K287G、K293G、 K336G和K434G對(duì)Hsf4b有激活作用。目前，這些位點(diǎn)調(diào)控Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的機(jī)理正在研究中。 目的 選取不同的賴氨酸位點(diǎn)進(jìn)行突變之后研究能調(diào)控Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性的賴氨酸及相關(guān)信號(hào)通路，為早期診斷和治療與Hsf4b突變相關(guān)的先天性白內(nèi)障提供理論依據(jù)。 方法1.設(shè)計(jì)并合成七對(duì)包含突變位點(diǎn)的引物，分別將Hsf4b上的192bp、618bp、672bp、861bp、879bp、1008bp和1302bp位的AAG/AAA突變成GGC。 2.以pWZL-blast-HA-Hsf4b質(zhì)粒為模板，用包含突變位點(diǎn)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得7個(gè)突變質(zhì)粒。 3.測(cè)序正確后，將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293-phoenix細(xì)胞中，用其分泌的含有病毒的上清感染mLEC/Hsf4b-/-細(xì)胞，并用藥物Blasticidin進(jìn)行篩選，獲得持續(xù)且穩(wěn)定表達(dá)突變型Hsf4b的細(xì)胞株。 4.用Western blot檢測(cè)突變后Hsf4b的表達(dá)情況，并檢測(cè)下游蛋白Hsp25和αB-晶體蛋白的表達(dá)差異。 5.通過(guò)Luciferase assay實(shí)驗(yàn)，來(lái)驗(yàn)證Hsf4b/K64G和Hsf4b/K293G下游基因αB-晶體蛋白（alpha B-crystallin）的表達(dá)差異。 結(jié)果 1.成功構(gòu)建了7個(gè)真核表達(dá)Hsf4b的突變體質(zhì)粒。 2.篩選出了持續(xù)且穩(wěn)定表達(dá)野生型Hsf4b和突變型Hsf4b的細(xì)胞株。 3.突變型Hsf4b蛋白表達(dá)量與野生型Hsf4b沒(méi)有差異。Hsf4b下游蛋白Hsp25和αB-晶體蛋白在mLEC/HA-Hsf4b/K287G、 mLEC/HA-Hsf4b/K293G，mLEC/HA-Hsf4b/K336G和mLEC/HA-Hsf4b/K434G細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯高于其在mLEC/HA-Hsf4b細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，而在mLEC/HA-Hsf4b/K64G，，mLEC/HA-Hsf4b/K206G和mLEC/HA-Hsf4b/K224G細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)則明顯低于其在mLEC/HA-Hsf4b細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。 4. Luciferase assay實(shí)驗(yàn)初步說(shuō)明了Hsf4b/K64G能明顯抑制αB-晶體蛋白（alphaB-crystallin）基因啟動(dòng)子的活性，而Hsf4b/K293G則能激活αB-晶體蛋白（alphaB-crystallin）基因啟動(dòng)子。 結(jié)論 翻譯后修飾賴氨酸對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄有不同的的調(diào)控活性，其中K64、K206和K224位點(diǎn)對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性起正調(diào)控作用，而K287、K293、K336和K434位點(diǎn)對(duì)Hsf4b轉(zhuǎn)錄活性起負(fù)調(diào)控作用。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R776.1

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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2 劉泰麟;趙翔;李立新;;蛋白質(zhì)的品質(zhì)管理[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年04期

3 常蘊(yùn)華,徐存拴;生物的熱休克反應(yīng)研究進(jìn)展[J];動(dòng)物學(xué)雜志;2001年03期

4 李建平,張葆欣,王瑞元,葉春;熱休克反應(yīng)對(duì)急性運(yùn)動(dòng)大鼠心肌自由基代謝的影響[J];北京體育大學(xué)學(xué)報(bào);2004年02期

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7 高前進(jìn);王二利;王瑞元;;骨骼肌熱休克蛋白變化研究進(jìn)展[J];北京體育大學(xué)學(xué)報(bào);2007年07期

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9 李冰,張祥盛;HSP70與c-fos蛋白在喉癌中表達(dá)的相關(guān)性[J];濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2002年03期

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中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 邢淑蓮;周益林;段霞瑜;鄒亞飛;;生物熱激蛋白及真菌HSP70的研究進(jìn)展[A];植保科技創(chuàng)新與病蟲(chóng)防控專業(yè)化——中國(guó)植物保護(hù)學(xué)會(huì)2011年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2011年

2 李兆群;張帥;王春義;雒s

本文編號(hào)：1288889