發(fā)布時間：2017-12-03 07:06

  本文關(guān)鍵詞：Annexin A5基因沉默對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響

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【摘要】：目的： （1）檢測Hep-2細(xì)胞中annexin A5基因相關(guān)特異干擾小RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染效率,分析siRNA轉(zhuǎn)入Hep-2細(xì)胞對其生長情況的影響。 （2）從基因水平及蛋白水平檢測當(dāng)特異siRNA轉(zhuǎn)入Hep-2細(xì)胞后,對annexinA5基因表達(dá)的影響。 （3）分析當(dāng)annexin A5基因沉默后對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響,探索annexin A5基因與Hep-2細(xì)胞凋亡的關(guān)系。 方法： （1）采用siDirect Version2.0軟件設(shè)計特異annexin A5小干擾片段（siRNA）,篩選出符合條件的片段,經(jīng)Pubmed比對后;由TaKaRa公司進(jìn)行熒光標(biāo)記合成。采用含10%胎牛血清及1%青霉素鏈霉素的改良型RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人喉癌Hep-2細(xì)胞,使其鋪板至70%-80%或剛好鋪滿且處于對數(shù)生長期;由脂質(zhì)體Lipofectamine2000（Invitrogen，美國）結(jié)合siRNA載入Hep-2細(xì)胞中進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。采用熒光顯微鏡觀察并記錄siRNA轉(zhuǎn)染情況,從而計算轉(zhuǎn)染效率（熒光顯微鏡下直接計數(shù)法即鏡下隨機固定視野,計數(shù)一百個細(xì)胞,同時計數(shù)出其中熒光陽性的細(xì)胞計算百分率,至少重復(fù)三次）。 （2）當(dāng)annexinA5基因沉默后,采用半定量RT-PCR方法檢測實驗組Hep-2細(xì)胞中annexin A5基因是否明顯低于對照組;并采用western blotting檢測實驗組Hep-2細(xì)胞中annexinA5蛋白是否明顯低于對照組。 （3）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV-FITC/PI）（Keygen公司,中國）檢測annexinA5基因沉默后對實驗組Hep-2細(xì)胞凋亡的影響,探索annexinA5基因功能與Hep-2細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。 結(jié)果： （1）轉(zhuǎn)染結(jié)束后;采用熒光顯微鏡觀察并記錄siRNA轉(zhuǎn)染情況，，從而計算轉(zhuǎn)染效率;經(jīng)直接計數(shù)法（重復(fù)三次）,轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%-90%。 （2）半定量RT-PCR結(jié)果表明實驗組annexinA5基因明顯低于對照組。其中實驗siRNA組、陰性siRNA組、脂質(zhì)體組及空白細(xì)胞組的相對灰度值分別為0.70±0.03、1.18±0.05、1.17±0.06及1.23±0.07;經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析表明實驗組annexinA5在mRNA水平的灰度明顯弱于陰性siRNA組（t=-14.77,P=0.0010.05）、脂質(zhì)體組（t=-13.23,P=0.0010.05）及空白細(xì)胞組（t=-12.99,P=0.0020.05）;而各對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（陰性siRNA組與脂質(zhì)體組為t=0.31,P=0.77〉0.05、與空白細(xì)胞組為t=-0.98,P=0.39〉0.05、脂質(zhì)體組與空白細(xì)胞組為t=-1.21,P=0.30〉0.05）。Western blot結(jié)果表明實驗組annexinA5基因蛋白表達(dá)明顯低于對照組。其中實驗siRNA組、陰性siRNA組、脂質(zhì)體組及空白細(xì)胞組的相對灰度值分別為1.21±0.03、3.88±0.06、3.87±0.02及3.95±0.08；統(tǒng)計學(xué)分析表明annexin A5的蛋白的相對灰度值明顯弱于陰性siRNA組（t=-70.34,P=0.0000.05）、脂質(zhì)體組（t=-150.62,P=0.0000.05）及空白細(xì)胞組（t=-56.32,P=0.0000.05）;各對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（陰性siRNA組與脂質(zhì)體組為t=0.46,P=0.68〉0.05、與空白細(xì)胞組為t=-1.15,P=0.32〉0.05、脂質(zhì)體組與空白細(xì)胞組為t=-1.77,P=0.21〉0.05）。 （3）AnnexinV-FITC法結(jié)果提示當(dāng)annexinA5基因沉默后，人喉癌細(xì)胞Hep-2凋亡率明顯降低。實驗siRNA組、陰性siRNA組、脂質(zhì)體組及空白細(xì)胞組分別為4.43±0.12、13.67±0.22、13.66±0.12及13.35±0.13;實驗組細(xì)胞Hep-2凋亡率（4.43%±0.12）較陰性siRNA組（t=-62.50,P=0.0000.05）、脂質(zhì)體組（t=-14.16,P=0.0050.05）及空白細(xì)胞組（t=-11.47,P=0.0070.05）明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;各對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（陰性siRNA組與脂質(zhì)體組為t=0.03,P=0.98〉0.05、與空白細(xì)胞組為t=0.42,P=0.72〉0.05、脂質(zhì)體組與空白細(xì)胞組為t=0.31,P=0.77〉0.05）。 結(jié)論：本研究證實在人喉癌Hep-2細(xì)胞中，當(dāng)annexin A5基因沉默后;人喉癌細(xì)胞Hep-2凋亡率明顯降低。而腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生改變對腫瘤的克隆性生長中起著重要作用,以及對腫瘤的診斷、治療、甚至預(yù)后都起著舉足輕重的作用。而研究表明annexin A5基因可促進(jìn)Hep-2細(xì)胞的凋亡,這可能成為喉癌診斷,治療及預(yù)后的新的生物靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：川北醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1247821