本文關(guān)鍵詞：USP22ShRNA慢病毒載體的構(gòu)建及其干擾人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的研究

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【摘要】：目的構(gòu)建并鑒定USP22ShRNA慢病毒載體，成功感染人鼻咽癌細(xì)胞，研究其對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞中USP22基因表達(dá)的抑制效率，建立USP22shRNA慢病毒載體穩(wěn)定干擾細(xì)胞系，為進(jìn)一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法針對(duì)USP22基因的編碼序列設(shè)計(jì)并合成2條特異性干擾序列，序列兩端含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)HpaI和XhoI。寡核苷酸鏈退火生成寡核苷酸雙鏈，5’端磷酸化后將含有酶切位點(diǎn)的寡核苷酸雙鏈克隆到pLL3.7慢病毒表達(dá)載體。連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒，提取出來(lái)的質(zhì)粒經(jīng)HpaI和XhoI酶切電泳鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。構(gòu)建成功的慢病毒表達(dá)載體pLL-USP22-shRNA與包裝載體質(zhì)�；靹蚬厕D(zhuǎn)染于293T細(xì)胞。通過(guò)熒光顯微鏡下觀察GFP情況，對(duì)病毒滴度和感染效率進(jìn)行檢測(cè)。在適合的感染復(fù)數(shù)條件下，將包裝成功的慢病毒原液感染至人鼻咽癌細(xì)胞。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Western blot檢測(cè)感染前后USP22基因及蛋白表達(dá)水平的變化，，得到干擾抑制USP22基因表達(dá)的效率。 結(jié)果成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pLL-USP22-shRNA，通過(guò)限制性內(nèi)切酶HpaI和XhoI酶切電泳和測(cè)序鑒定結(jié)果正確。慢病毒表達(dá)載體與包裝載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后測(cè)定慢病毒滴度為4×107TU/ml，說(shuō)明病毒轉(zhuǎn)染成功，適合感染目的細(xì)胞。在感染復(fù)數(shù)50的條件下，慢病毒感染至人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2的感染效率大于95%。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Western blot檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染后CNE-2細(xì)胞中USP22基因表達(dá)受到抑制，抑制效率為64.03%。 結(jié)論應(yīng)用相關(guān)基因工程技術(shù)成功構(gòu)建USP22ShRNA慢病毒載體，并能成功的感染人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2，很好的抑制了人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2中USP22基因的表達(dá)，建立了USP22shRNA慢病毒載體穩(wěn)定干擾CNE-2細(xì)胞系。為進(jìn)一步研究USP22基因在人鼻咽癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 熊建軍;干麗君;林玲;龔幀;吳周環(huán);李衛(wèi)東;;泛素特異水解酶22基因RNA干擾真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年02期

本文編號(hào)：1203139