本文關(guān)鍵詞：缺氧調(diào)控端粒酶活性及抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：背景 缺氧對(duì)包括鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)在內(nèi)的惡性腫瘤的血管形成、腫瘤增殖、耐藥、轉(zhuǎn)移及凋亡等多方面顯著相關(guān)。但缺氧導(dǎo)致腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制到目前為止還不是很清楚。已有研究證實(shí)核轉(zhuǎn)錄因子HIF-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)在缺氧引起的腫瘤生長(zhǎng)和惡性進(jìn)展中起著樞紐作用。 我們?cè)诒茄拾┣捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),端粒酶及其亞單位(telomerase catalytic subunit, hTERT)在包括鼻咽癌在內(nèi)的絕大多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá),端粒酶高活性是導(dǎo)致惡性腫瘤無(wú)限增殖、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因。目前研究發(fā)現(xiàn),缺氧所導(dǎo)致的上調(diào)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及化療耐藥作用有可能是通過(guò)上調(diào)腫瘤細(xì)胞端粒酶活性實(shí)現(xiàn)的,且核轉(zhuǎn)錄因子HIF-1在調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。 基于鼻咽癌與端粒酶的密切關(guān)系,本研究擬探討缺氧對(duì)鼻咽癌細(xì)胞端粒酶及其亞單位活性的作用以及對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及化療耐藥等生物學(xué)行為的影響；siRNA干擾HIF1α后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞端粒酶及其亞單位活性抑制作用及對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移抑制、逆轉(zhuǎn)耐藥的影響。進(jìn)一步為腫瘤缺氧提供新的見(jiàn)解,作為癌癥治療的新靶點(diǎn)。 目的 探討缺氧及干預(yù)因素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞端粒酶及其亞單位活性的作用以及對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及化療耐藥生物學(xué)行為的影響。 研究?jī)?nèi)容和方法 1.細(xì)胞培養(yǎng)及缺氧處理 5-8F和CNE2細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下(5%C02、37℃)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素100U/mL,鏈霉素100μg/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基中。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)。常規(guī)使用0.25%胰酶(含EDTA)消化傳代。所有實(shí)驗(yàn)均選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。缺氧處理,細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理后,由常氧C02培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移至已調(diào)節(jié)穩(wěn)定的三氣培養(yǎng)箱中(包含1%O2,5%CO2,和94%N2)。 2.缺氧對(duì)鼻咽癌細(xì)胞端粒酶及其亞單位活性作用的影響 2.1缺氧對(duì)鼻咽癌細(xì)胞HIF1α和hTERT基因表達(dá)的影響 5-8F和CNE2細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板,將未融合的細(xì)胞缺氧培養(yǎng)0h-72h,采用SDS裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量,免疫印跡法檢測(cè)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、4、8、16、24、48、72h) HIF1α和hTERT蛋白的相對(duì)表達(dá)量。以β-actin為內(nèi)參。 2.2鼻咽癌細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HIF1α-siRNA并檢測(cè)其轉(zhuǎn)染率 5-8F和CNE2細(xì)胞以2～2.5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔板為5×103個(gè)/孔),12小時(shí)后細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%,更換無(wú)血清培養(yǎng)基。按照說(shuō)明書(shū),采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染siRNA, siRNA轉(zhuǎn)染的終濃度為30nM。 Negative-siRNA標(biāo)記有Cy3熒光,6h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染率,每批細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。 2.3篩選沉默HIF1α效果最好的siRNA 5-8F和CNE2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染3對(duì)siRNA(HIF1α-siRNA-1、HIF1α-siRNA-2和HIF1α-siRNA-3)、Negative-siRNA和轉(zhuǎn)染間質(zhì)Lipofactamine2000,常氧或缺氧培養(yǎng)48h,熒光定量PCR法檢測(cè)HIF1α mRNA的相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,同時(shí)擴(kuò)增P-actin作為內(nèi)參。然后篩選出能有效抑制HIF1α表達(dá)的siRNA序列。 2.4HIF1α-siRNA沉默HIF1α后對(duì)HIF1α及hTERT基因表達(dá)的影響 5-8F和CNE2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HIF1α-siRNA和Negative-siRNA,常氧或缺氧培養(yǎng)48h,采用熒光定量PCR法和免疫印跡法檢測(cè)HIF1α和hTERT基因mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 3. HIF1α-siRNA抑制HIF1α對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及耐藥性的影響 3.1鼻咽癌細(xì)胞周期檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分4組：未處理組(常氧)、未處理組(缺氧)、HIF1α-siRNA組(缺氧)和Negative-siRNA組(缺氧)。CNE2和5-8F細(xì)胞各以2～2.5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,按實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后常氧培養(yǎng)12h,再繼續(xù)常氧或缺氧持續(xù)培養(yǎng)36h后。收集細(xì)胞并用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL,加入預(yù)冷的70%乙醇,4℃固定過(guò)夜,洗滌離心后加入100μLRnase A和400μL PI,37℃避光染色30min,流式細(xì)胞儀行上述細(xì)胞周期檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次,每批細(xì)胞設(shè)2個(gè)樣品。 3.2Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力 5-8F和CNE2細(xì)胞各以2～2.5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板,按實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染(實(shí)驗(yàn)分組同上),轉(zhuǎn)染后常氧培養(yǎng)12h,再繼續(xù)常氧或缺氧持續(xù)培養(yǎng)36h后。收集細(xì)胞并用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL,加入預(yù)冷的70%乙醇,4℃固定過(guò)夜,洗滌離心后加入100μL Rnase A和400μL PI,37℃避光染色30min,流式細(xì)胞儀行上述細(xì)胞周期檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 3.3MTT法測(cè)定siRNA沉默后對(duì)DDP及5-Fu化療藥物療效的增敏情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5-8F和CNE2細(xì)胞配成單細(xì)胞懸液,以1×104個(gè)／孔接種于96孔板中,200μL/孔；細(xì)胞培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)染siRNA(實(shí)驗(yàn)分組同上),轉(zhuǎn)染后12h每組各加入相應(yīng)濃度的DDP (0、5、10、15、25、75、100μg/mL)和5-FU (0、10、25、50、75、100、150μg/mL),分別設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,常氧或缺氧培養(yǎng)36h后,加入MTT溶液(5mg/mL)20μL/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng),小心棄掉孔內(nèi)的培養(yǎng)上清液,每孔加入150μL的DMSO后避光振蕩10min,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定波長(zhǎng)為570nm處各孔的吸光度(OD)值。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算DDP和5-Fu對(duì)細(xì)胞的IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 4.統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理結(jié)果,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析。P0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.缺氧處理后鼻咽癌細(xì)胞HIFlα及]hTERT的表達(dá)情況 鼻咽癌5-8F和CNE2細(xì)胞缺氧培養(yǎng)(1%O2)0h-72h,采用免疫印跡檢測(cè)缺氧培養(yǎng)對(duì)HIFlα和hTERT基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,常氧條件下CNE2和5-8F細(xì)胞既有一定水平HIFlα和hTERT的表達(dá),隨著缺氧處理時(shí)間的延長(zhǎng),5-8F細(xì)胞HIF1α和hTERT蛋白表達(dá)水分別在16、24h達(dá)到峰值,CNE2細(xì)胞HIFlα和hTERT蛋白表達(dá)水平在24h達(dá)到峰值,以后隨著缺氧處理時(shí)間的延長(zhǎng),兩種鼻咽癌細(xì)胞中HIF1α和hTERT蛋白表達(dá)均逐漸降低。說(shuō)明缺氧可以上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞株CNE2和5-8F的HIF1α和hTERT蛋白表達(dá)。 2.鼻咽癌細(xì)胞siRNA的轉(zhuǎn)染效率 采用Lipofactamine2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染化療合成的Negative-siRNA-Cy3,轉(zhuǎn)染后12h(6至24h內(nèi))熒光顯微鏡下肉眼觀察被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞發(fā)紅色熒光,流式細(xì)胞儀檢測(cè)5-8F和CNE2細(xì)胞轉(zhuǎn)染率分別為(98.8334±1.070)%、(98.367±0.586)%。 3. HIF1α-siRNA特異性抑制HIF1α和hTERT基因表達(dá)的情況 將siRNA(HIF1α-siRNA-1、HIF1α-siRNA-2和HIF1α-siRNA-3)及Negative-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到鼻咽癌5-8F和CNE2細(xì)胞,熒光定量PCR檢測(cè)各組HIF1α mRNA的相對(duì)水平。結(jié)果顯示,在5-8F細(xì)胞,siRNA1-3組HIF1α mRNA表達(dá)水平與未處理組相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中siRNA-1組與未處理組的差異最顯著。在CNE2細(xì)胞,只有siRNA-1與未處理組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩種細(xì)胞均顯示,Negative-siRNA組與未處理組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。在兩種細(xì)胞株均顯示HIF1α-siRNA-1下調(diào)HIF1α mRNA的效果最明顯,5-8F和CNE2細(xì)胞分別下調(diào)了0.703±0.021、0.813±0.012。因此,選擇HIF1α-siRNA-1作為HIF1α特異性siRNA的。 熒光定量PCR法及免疫印跡法檢測(cè)HIF1α-siRNA對(duì)鼻咽癌細(xì)胞HIF1α和hTERT基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,缺氧情況下抑制HIF1α后,兩組細(xì)胞HIF1α和hTERT的表達(dá)均顯著下調(diào),在5-8F細(xì)胞中,HIF1α的mRNA和蛋白水平分別下調(diào)了0.710±0.020和0.583±0.065, hTERT的mRNA和蛋白水平分別下調(diào)了0.633±0.051和0.492±0.069；在CNE2細(xì)胞中,HIF1α的mRNA和蛋白水平分別下調(diào)了0.799±0.023和0.649±0.193,hTERT的mRNA和蛋白水平分別下調(diào)了0.677±0.067和0.746±0.089。兩組細(xì)胞中HIF1α和hTERT的mRNA與蛋白水平下調(diào)相一致。 4.缺氧及干擾HIF1α后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞周期的影響 為了探索缺氧對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活性的影響及化療耐藥的機(jī)制,我們采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的作用及HIF1α-siRNA抑制HIF1α對(duì)該種腫瘤細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示,缺氧誘導(dǎo)CNE2細(xì)胞G1/S阻滯,而5-8F細(xì)胞沒(méi)有顯著的G1/S阻滯(即無(wú)明顯G0/G1峰增加,S峰下降)。缺氧條件下,抑制HIF1α的表達(dá)后,鼻咽癌CNE2細(xì)胞G0/G1期的比例下降(P0.05),部分GO和G1期的細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期循環(huán),G2/M期細(xì)胞增多(P0.05)；而鼻咽癌5-8F細(xì)胞中,S期細(xì)胞分布減少(P0.05),而G2/M期上升(P0.05),GO/G1期無(wú)顯著變化。兩種細(xì)胞均顯示,未處理組(缺氧)與Negative-siRNA缺氧組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。 5.沉默HIF1α顯著降低鼻咽癌細(xì)胞的遷移能力 缺氧明顯促進(jìn)5-8F和CNE2細(xì)胞的遷移(P0.05)。缺氧情況下,沉默HIF1α,與未處理組和Negative-siRNA組比較,在兩種細(xì)胞均顯示,HIF1α-siRNA組的遷移能力顯著下降(P0.05)。Negative-siRNA組和未處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6. HIF1α干擾后DDP及5-Fu對(duì)鼻咽癌細(xì)胞作用的化療敏感性結(jié)果 隨著藥物濃度的增加,5-Fu對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增強(qiáng),在缺氧情況下,鼻咽癌5-8F和CNE2細(xì)胞對(duì)5-Fu的化療敏感性均明顯降低,P0.05,HIF1α被干擾后,5-Fu對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的IC50值明顯低于未處理組和Negative-siRNA組,P0.05,未處理組和Negative-siRNA組的ICso值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。另外,缺氧處理5-8F和CNE2細(xì)胞對(duì)DDP的化療敏感性也降低(P0.05),抑制HIF1α后,顯著上調(diào)了鼻咽癌細(xì)胞對(duì)DDP的化療敏感性(P0.05)。 結(jié)論 缺氧可能通過(guò)上調(diào)hTERT促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展及腫瘤耐藥,干擾HIF1α后,可以明顯抑制hTERT表達(dá)并提高常用化療藥物的作用效果。提示缺氧對(duì)鼻咽癌生物學(xué)的影響可能是通過(guò)端粒酶活性變化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究為鼻咽癌靶向基因治療提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.63

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1193499