本文關(guān)鍵詞：維甲酸誘導(dǎo)內(nèi)耳祖代細胞分化的研究

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【摘要】：目的：觀察體外無血清培養(yǎng)基條件下維甲酸（RA）能否誘導(dǎo)內(nèi)耳祖代細胞分化為毛細胞。 方法：取凍存內(nèi)耳祖代細胞（CNPs）解凍后在25cm2的培養(yǎng)板中用DMEM/F12+N2+EGF+bFGF無血清培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)3天，取生長狀態(tài)良好的細胞在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特點。選擇生長狀態(tài)良好的細胞，用細胞免疫化學(xué)方法檢測神經(jīng)干細胞標(biāo)志蛋白（Nestin）的表達，進一步鑒定細胞的分化情況。 實驗分為實驗組和對照組。內(nèi)耳祖代細胞爬片后用培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)液每天更換。誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后收集細胞進一步檢測。實驗組分別進行如下實驗：①用DMEM/F12+RA（10-6M）培養(yǎng)液進行誘導(dǎo)。②用細胞免疫熒光方法檢測毛細胞標(biāo)志物Math1、MyosinⅦa蛋白的表達；③提取誘導(dǎo)后的內(nèi)耳祖代細胞的RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性；RT-PCR進行基因擴增，然后進一步用瓊脂糖凝膠電泳檢測毛細胞標(biāo)志物基因的表達情況；④用Brdu熒光染色法檢測細胞增殖，并用鬼筆環(huán)肽檢測細胞骨架F-actin的表達情況。對照組細胞用DMEM/F12+DMSO(0.11mg/ml）培養(yǎng)液誘導(dǎo)。 結(jié)果： 1.內(nèi)耳祖代細胞（CNPs）均可見到Nestin的表達。 2.細胞免疫熒光法顯示實驗組和對照組均可見熒光，實驗組和對照組Math1+、MyosinⅦa+細胞率分別是63%,1.5%;56%,0.96%。 3.RT-PCR電泳結(jié)果顯示實驗組和對照組毛細胞標(biāo)志物基因均有表達，但實驗組的電泳條帶較對照組明顯。 4.細胞增殖實驗檢測顯示Brdu+細胞率RA組(20.6%)小于陰性對照(29.9%)組和陽性對照組(54.3%)，，陰性對照組和陽性對照組之間有差異。 5.F-actin細胞免疫熒光法對照組的細胞纖維方向相對一致，對照組纖維方向較亂，但熒光強度顯示ctrl組，處理3天的對照組與實驗組的差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義，分別為21.60,22.60,24.50。 結(jié)論： 1.內(nèi)耳祖代細胞（CNPs）在無血清條件下生長良好，但未觀察到明顯分化現(xiàn)象，保持了神經(jīng)干細胞的特性。 2.經(jīng)RA誘導(dǎo)培養(yǎng)的內(nèi)耳祖代細胞毛細胞標(biāo)志物Math1、MyosinⅦa明顯增高，推測RA可能促使內(nèi)耳祖代細胞分化為毛細胞。 3.RA體外抑制了內(nèi)耳祖代細胞增殖；RA促進內(nèi)耳祖代細胞細胞骨架F-actin重新分布，但并未促進細胞骨架F-actin的形成。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)耳祖代細胞 Math1 MyosinⅦa RA F-actin
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R764.431
【目錄】：

• 主要縮略詞及中英文對照4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 1 內(nèi)耳祖代細胞的培養(yǎng)11-16
• 1.1 實驗材料11-12
• 1.2 CNPs 的培養(yǎng)和傳代12-13
• 1.3 神經(jīng)干細胞的特異性標(biāo)志物 nestin 在內(nèi)耳祖代細胞中的表達13-14
• 1.4 實驗結(jié)果14-15
• 附圖15-16
• 2 在體外 RA 誘導(dǎo)內(nèi)耳祖代細胞分化為毛細胞的研究16-26
• 2.1 實驗材料16-17
• 2.2 CNPs 細胞的誘導(dǎo)17
• 2.3 誘導(dǎo)后 CNPs 細胞 Math1、Myosin7a 細胞免疫熒光檢測17-18
• 2.4 RT-PCR 檢測誘導(dǎo)后細胞 Math1、Myosin7a 的 mRNA 表達情況18-20
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析20
• 2.6 實驗結(jié)果20-22
• 附圖22-26
• 3 在體外 RA 對內(nèi)耳祖代細胞細胞骨架 F-actin 的影響26-33
• 3.1 實驗材料26-27
• 3.2 細胞增殖——Brdu 實驗27-28
• 3.3 RA 對內(nèi)耳祖代細胞細胞骨架 F-actin 的影響28-29
• 3.4 統(tǒng)計學(xué)分析29
• 3.5 實驗結(jié)果29-30
• Brdu 檢測細胞增殖29
• RA 對內(nèi)耳祖代細胞細胞骨架 F-actin 的影響29
• 結(jié)論29-30
• 附圖30-33
• 討論33-38
• 1.內(nèi)耳祖代的特點和優(yōu)勢33
• 2.毛細胞的特征性標(biāo)志物和誘導(dǎo)毛細胞分化的相關(guān)因子33-35
• 3.內(nèi)耳祖代細胞經(jīng)誘導(dǎo)能分化為毛細胞35-37
• 4.抑制內(nèi)耳祖代細胞增殖能促進其分化37
• 5.維甲酸對 f-actin 的作用37-38
• 結(jié)論38-39
• 參考文獻39-43
• 致謝43-44
• 綜述44-55
• 參考文獻51-55

本文編號：1116021