本文關(guān)鍵詞：Atoh1過(guò)表達(dá)調(diào)控哺乳動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞再生的體外研究

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【摘要】：目的：Atohl/Math 1基因誘導(dǎo)耳蝸原位及異位毛細(xì)胞再生已經(jīng)得到體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),抑制Notch信號(hào)通路可以誘導(dǎo)新生鼠及胚胎額外毛細(xì)胞再生,但Notch信號(hào)通路與Atohl共同作用于新霉素處理后的感覺(jué)上皮誘導(dǎo)毛細(xì)胞再生的效果尚無(wú)研究。Atohl表達(dá)水平?jīng)Q定內(nèi)外毛細(xì)胞發(fā)育、成熟,但是否同樣決定異位毛細(xì)胞樣細(xì)胞發(fā)育成熟未得到證實(shí)。且異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞是否會(huì)類似發(fā)育中的內(nèi)外毛細(xì)胞發(fā)生匯聚伸展現(xiàn)象,又與哪些調(diào)控因素有關(guān)未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本研究擬解決如下問(wèn)題：1) Atohl過(guò)表達(dá)及Notch通路抑制劑DAPT單獨(dú)或聯(lián)合作用新霉素處理后的大鼠基底膜,觀察原位區(qū)域毛細(xì)胞樣細(xì)胞是否具有差異；2)不同滴度的Ad5-EGFP-Atohl作用于體外培養(yǎng)的基底膜,觀察小上皮脊異位毛細(xì)胞樣細(xì)胞的數(shù)目變化及纖毛發(fā)育、成熟。3) Ad5-EGFP-Atohl誘導(dǎo)產(chǎn)生的異位毛細(xì)胞樣細(xì)胞是否具有匯聚伸展現(xiàn)象及其影響因素。方法：本研究以體外培養(yǎng)耳蝸基底膜誘導(dǎo)毛細(xì)胞再生為模型。1)取耳蝸中圈基底膜體外培養(yǎng),新霉素處理后,不同濃度胎牛血清共培養(yǎng),然后行Ad5-EGFP-Atohl/Ad5-EGFP轉(zhuǎn)染, 取耳蝸感覺(jué)上皮高效轉(zhuǎn)染的基底膜進(jìn)行Notch信號(hào)通路阻滯劑培養(yǎng),轉(zhuǎn)染8天后沿耳蝸感覺(jué)上皮區(qū)域長(zhǎng)軸方向計(jì)數(shù)200um范圍內(nèi)Myosin7a陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。并利用激光共聚焦和T檢驗(yàn)從形態(tài)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)角度驗(yàn)證和分析抑制Notch信號(hào)通路對(duì)Atoh1誘導(dǎo)的原位區(qū)域毛細(xì)胞再生的調(diào)控作用。2)分別使用0.16×108,0.4×108,0.8×108,1.6×108,2.4×108 PFU/mlAd5-EGFP-Atoh1轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的中圈基底膜,對(duì)病毒轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本進(jìn)行固定和免疫組織化學(xué)染色,計(jì)數(shù)不同滴度的病毒組不同時(shí)間點(diǎn)小上皮脊非感覺(jué)上皮異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞的數(shù)目,并觀察異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)變化及纖毛變化。3)觀察不同病毒組不同時(shí)間點(diǎn)小上皮脊最外側(cè)異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞至感覺(jué)區(qū)域的距離變化及異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞之間的間距變化,評(píng)估異位異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞是否具有群體匯聚伸展現(xiàn)象,并分析相關(guān)調(diào)控因素。結(jié)果：1)、①新霉素處理的基底膜經(jīng)10%血清培養(yǎng)48h后,支持細(xì)胞間距明顯變大,感覺(jué)上皮Atohl轉(zhuǎn)染效率增加。②Atoh1過(guò)表達(dá)于耳蝸感覺(jué)上皮后感覺(jué)區(qū)域新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞生成。③Notch通路抑制劑DAPT與Atohl共同作用于耳蝸感覺(jué)上皮,原位區(qū)域毛細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)目明顯增多。EGFP對(duì)照組、DAPT、DMSO單獨(dú)作用于耳蝸感覺(jué)上皮無(wú)新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞生成。 2)、①梯度為0.16×108,0.4x10* , 0.8xlO8 , 1.6x10* PFU/ml的腺病毒轉(zhuǎn)染基底膜24小時(shí)后,小上皮脊區(qū)域轉(zhuǎn)染效率隨濃度上升逐漸增加。2.4xlO8 PFU/ml組基底膜組織破壞、細(xì)胞離斷。? 0.16xl08 PFU/ml組在不同的時(shí)間點(diǎn)均未觀察到異位毛細(xì)胞樣細(xì)胞。0.4x10*, 0.8x10*, 1.6x10* PFU/ml組小上皮脊區(qū)域異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)目隨病毒滴度增加而增加,隨Atohl作用時(shí)間增加而增加。③Atohl表達(dá)水平高的非感覺(jué)細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)快速變?yōu)楫愇恍律?xì)胞樣細(xì)胞,表達(dá)水平低的細(xì)胞逐漸變?yōu)楫愇恍律?xì)胞樣細(xì)胞,Atohl表達(dá)水平過(guò)低的細(xì)胞無(wú)法轉(zhuǎn)變?yōu)槊?xì)胞樣細(xì)胞,部分未能成功轉(zhuǎn)變?yōu)楫愇恍律?xì)胞樣細(xì)胞的非感覺(jué)細(xì)胞部分逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楦杏X(jué)前體細(xì)胞。?O.lxiO8 -1.6x10* PFU/ml濃度范圍內(nèi), 異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞纖毛形態(tài)隨Atohl表達(dá)水平增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸發(fā)育、成熟,形態(tài)近似于V字型。3X (DAtohl誘導(dǎo)的異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞可自發(fā)發(fā)生群體匯聚遷移運(yùn)動(dòng),最外側(cè)細(xì)胞逐漸、緩慢向Corti's區(qū)域遷移運(yùn)動(dòng),最終與內(nèi)外毛細(xì)胞融合為一體,對(duì)照組小上皮脊細(xì)胞未觀察到動(dòng)態(tài)改變。? 0.4x10*-1.6x10* PFU/ml濃度范圍內(nèi),異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞群體匯聚遷移速度隨Atohl表達(dá)水平及作用時(shí)間增加而增加。③異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞表面細(xì)胞粘附蛋白E-cadherin表達(dá)水平高,對(duì)照組的表達(dá)低。結(jié)論： 1)、①新霉素與血清共同作用提高感覺(jué)上皮腺病毒轉(zhuǎn)染效率。(2) Atohl過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)感覺(jué)上皮區(qū)域新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞再生。Notch通路抑制劑促進(jìn)Atohl誘導(dǎo)的耳蝸感覺(jué)上皮區(qū)域毛細(xì)胞再生作用。2)、①病毒轉(zhuǎn)染滴度不同,小上皮脊非感覺(jué)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不同。(DAtohl過(guò)表達(dá)水平越高,作用時(shí)間越長(zhǎng),異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞數(shù)目越多、纖毛形態(tài)越成熟。3)、異位新生毛細(xì)胞樣細(xì)胞具有群體自發(fā)性匯聚遷移現(xiàn)象,且與Atohl表達(dá)量及作用時(shí)間有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：Atoh1/Math1 Atoh1表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染效率 毛細(xì)胞樣細(xì)胞(HCLCs) 異位毛細(xì)胞樣細(xì)胞(EHCLCs) 纖毛 Notch信號(hào)通路抑制劑 DAPT 匯聚伸展(CE) 鈣粘附蛋白(E-cadherin) 小上皮脊(LER) 體外培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R764.43
【目錄】：

• 縮寫(xiě)詞表4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 第—部分：抑制Notch信號(hào)通路促進(jìn)Atoh1誘導(dǎo)的耳蝸毛細(xì)胞再生的體外研究11-25
• 前言11
• 材料11-12
• 實(shí)驗(yàn)方法12-15
• 附圖與結(jié)果15-22
• 結(jié)果22
• 討論22-24
• 結(jié)論24-25
• 第二部分：Atoh1表達(dá)水平及作用時(shí)間調(diào)控耳蝸異位毛細(xì)胞再生25-42
• 前言25
• 材料25-26
• 實(shí)驗(yàn)方法26-28
• 附圖與結(jié)果28-39
• 結(jié)果39
• 討論39-41
• 結(jié)論41-42
• 第三部分：Atoh1誘導(dǎo)的異位再生毛細(xì)胞群體匯聚遷移現(xiàn)象及相關(guān)影響因素42-54
• 前言42
• 材料42-43
• 實(shí)驗(yàn)方法43-44
• 附圖與結(jié)果44-50
• 結(jié)果50
• 討論50-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 全文小結(jié)57-58
• 綜述58-65
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 承擔(dān)科研項(xiàng)目65-66
• 發(fā)表文章66-67
• 致謝67-69

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 萬(wàn)勇;成骨細(xì)胞分泌的Wnt蛋白對(duì)于骨質(zhì)重塑和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的維持的調(diào)控[D];上海交通大學(xué);2013年

2 叢寧;Math1誘導(dǎo)體外聽(tīng)覺(jué)感覺(jué)上皮再生[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 晉鳳珍;功能蛋白的0-糖基化參與調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的遷移以及E-鈣粘蛋白的表達(dá)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

2 戴尉君;Math-1/NGF-b基因共轉(zhuǎn)染治療噪聲性聽(tīng)力損傷的基礎(chǔ)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

3 張平平;低糖基化E-cadherins抑制舌癌細(xì)胞增殖和侵襲的機(jī)理研究[D];山東大學(xué);2014年

4 李中凡;P120-catenin和VE-cadherin在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤壁的表達(dá)及意義[D];南昌大學(xué);2014年

5 馬銳;抑制FGF信號(hào)通路對(duì)橢圓囊毛細(xì)胞再生的調(diào)控研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：1089926