本文關(guān)鍵詞：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)方法的優(yōu)化及其在探索再生障礙性貧血發(fā)病機(jī)制中的應(yīng)用

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【摘要】：背景：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSC)是一種具有高度自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞,其來源廣泛,骨髓、胎盤、臍血等組織中均可以培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞。由于MSCs在體外擴(kuò)增迅速,并且可在特定體外培養(yǎng)條件下分化為成骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞,脂肪細(xì)胞等,間充質(zhì)干細(xì)胞已成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)中理想的種子細(xì)胞。不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性不盡相同,因此應(yīng)用于基礎(chǔ)及臨床研究時(shí)用途有所差異。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)因更易向成脂分化和研究較為深入,成為脂肪組織再生修復(fù)的理想材料。在臨床工作中,軟組織損傷病人常面臨著修復(fù)的難題,如燒傷病人、HIV患者通常伴有軟組織萎縮和面部脂質(zhì)代謝障礙,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域,成脂分化也為研究干細(xì)胞分化機(jī)制提供了良好的模型。由于研究方向廣泛,細(xì)胞來源不同,間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)方法也各不相同。因而常常導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果間不能相互比較,極大的阻礙了成脂的相關(guān)研究。同時(shí),目前常用的成脂誘導(dǎo)體系培養(yǎng)周期較長,浪費(fèi)了大量的時(shí)間和物質(zhì)成本。因此,有必要深入了解不同成脂誘導(dǎo)方法對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特性的影響。本研究旨在比較不同成脂培養(yǎng)體系下人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂特性,并進(jìn)一步比較不同成脂誘導(dǎo)體系的成脂效率,為優(yōu)化成脂誘導(dǎo)方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的：(1)比較人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同成脂誘導(dǎo)條件下的成脂特性；(2)比較不同成脂誘導(dǎo)方法的誘導(dǎo)效率,優(yōu)化成脂誘導(dǎo)方法。方法：(1)采用三種不同成脂誘導(dǎo)體系對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外成脂誘導(dǎo)。(2)應(yīng)用Real-time PCR方法檢測成脂誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)處人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂相關(guān)基因PPARγ、FABP-4、adiponectin等的表達(dá)情況。(3)采用ELISA方法檢測成脂誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)處培養(yǎng)上清中adiponectin的分泌量。(4)共聚焦顯微鏡檢測成脂誘導(dǎo)后油紅染色情況。(5)應(yīng)用Western blot方法檢測成脂過程中PPARγ,C/EBPβ的表達(dá)情況。結(jié)果：(1)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同成脂誘導(dǎo)體系下成脂相關(guān)基因的表達(dá)水平不同。 DIMR組對PPARγ、FABP-4、adiponectin、C/EBPα、LPL的誘導(dǎo)作用高于其余兩組。(2)隨成脂誘導(dǎo)進(jìn)程,三組adiponectin的分泌量均逐漸上升,DIMR組分泌水平均高于其余兩組。(3)各成脂誘導(dǎo)方法的成脂效率不同。DIMR組可在成脂誘導(dǎo)早期7-8天即可誘導(dǎo)較多脂滴產(chǎn)生。(4)在成脂誘導(dǎo)早期,DIMI組較其他兩組誘導(dǎo)表達(dá)更多的PPARy蛋白,但PPARy蛋白表達(dá)量并不隨成脂時(shí)間延長持續(xù)增加。在DIMR組中PPAR γ表達(dá)量并不隨成脂誘導(dǎo)時(shí)間逐漸增加。結(jié)論：(1)不同成脂誘導(dǎo)體系下,人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出不同的成脂特性。(2)DIMR培養(yǎng)方法有更高的成脂效率,誘導(dǎo)7天即可觀察到脂滴形成,可以此作為成脂誘導(dǎo)的觀測時(shí)間點(diǎn)。(3)在DIMR組中PPARy蛋白表達(dá)量不能成為檢測成脂誘導(dǎo)效果的良好指標(biāo)。背景：再生障礙性貧血(aplastic anemia, AA)是由骨髓造血功能衰竭所致的,以全血細(xì)胞減少為特征的疾病,其病理機(jī)制復(fù)雜。大量的實(shí)驗(yàn)室和臨床數(shù)據(jù)表明免疫功能異常介導(dǎo)的造血抑制在獲得性再障的病理機(jī)制中發(fā)揮重要作用。然而,很多相關(guān)研究也證實(shí),再障患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)存在著明顯缺陷和異常,如增殖受抑制,造血支持能力下降,免疫抑制能力降低等,這將使他們更易發(fā)生骨髓衰竭。因此,再障患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能異常將可能會參與其發(fā)病。瘦素(Leptin)是一種主要由白色脂肪細(xì)胞分泌的生物活性分子。它不僅具有調(diào)解能量代謝、免疫等功能,還是一種促炎癥因子。leptin可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞向Th1方向極化。有研究證實(shí)它可以參與一些自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,多發(fā)性硬化等。在血液系統(tǒng)疾病中研究發(fā)現(xiàn),急性淋巴細(xì)胞白血病與急性粒細(xì)胞白血病患者骨髓中也高表達(dá)瘦素。目前對于瘦素與再障發(fā)病的相關(guān)性并無研究,因此我們初步探索了瘦素在再障患者骨髓中的含量及與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的聯(lián)系。本文通過檢測AA患者骨髓漿、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞leptin水平,檢測炎癥因子對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞leptin表達(dá)的影響,探討AA患者BM-MSCs對疾病發(fā)生可能存在的新機(jī)制。目的：由于瘦素具有明確的免疫調(diào)節(jié)功能,通過測定再障患者與正常對照骨髓漿中的含量,推測其與再障發(fā)病是否能具有一定的相關(guān)性。進(jìn)一步檢測再障患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的瘦素表達(dá)量水平,探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在再障發(fā)病中可能存在的新機(jī)制。方法：(1)收集再障及正常人骨髓標(biāo)本,離心收集骨髓漿,ELISA法檢測骨髓漿中瘦素含量；(2)采用貼壁、傳代培養(yǎng)的方法從再障患者和正常人骨髓組織中獲取相對純化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；(3)流式細(xì)胞儀檢測培養(yǎng)的BM-MSCs表面標(biāo)志；(4)定向誘導(dǎo)BM-MSCs向成脂分化,比較再障及正常來源BM-MSCs的分化潛能；(5)Real-time PCR法檢測再障及正常來源BM-MSCs中瘦素mRNA表達(dá)差異；(6)ELISA法檢測再障及正常來源BM-MSCs體外培養(yǎng)上清中瘦素的分泌量；(7)比較炎癥因子對成脂誘導(dǎo)過程中BM-MSCs產(chǎn)生瘦素的影響。結(jié)果：(1)再障患者骨髓漿中瘦素水平高于正常對照。(2)再障患者來源BM-MSCs在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)更多瘦素,體外培養(yǎng)上清中分泌的瘦素水平也顯著高于對照組。(3)炎癥因子可以抑制BM-MSCs向成脂分化,但在長期成脂過程中可促進(jìn)其分泌更多的瘦素。(4)再障來源BM-MSCs更易向成脂分化。(5)再障患者來源BM-MSCs在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)更多瘦素受體。結(jié)論：(1)再障患者骨髓漿表達(dá)更高瘦素水平。(2)再障患者BM-MSCs表達(dá)更高瘦素水平,可能是導(dǎo)致骨髓漿中瘦素水平上升的原因。(3)炎癥因子可能是導(dǎo)致BM-MSCs分泌更多的瘦素的原因。(4)再障來源BM-MSCs表達(dá)更高的瘦素受體水平,可能是導(dǎo)致骨髓脂肪化的一種機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成脂誘導(dǎo) PPARγ 再生障礙性貧血 瘦素 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 瘦素受體 炎癥因子
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R556.5
【目錄】：

• 第一部分 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)方法的優(yōu)化4-36
• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-10
• 材料和方法10-20
• 結(jié)果20-27
• 討論27-30
• 結(jié)論30-31
• 參考文獻(xiàn)31-36
• 第二部分 再障患者來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞瘦素及其受體的表達(dá)36-58
• 摘要36-38
• Abstract38-40
• 前言40-42
• 材料和方法42-45
• 結(jié)果45-50
• 討論50-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 附錄一 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑58-62
• 附錄二 主要溶液的配置62-65
• 附錄三 英文縮寫和代碼65-67
• 附錄四 在讀期間發(fā)表文章、參加會議67-68
• 致謝68-69

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本文編號：949849