本文關鍵詞：人骨髓間充質干細胞成脂誘導方法的優(yōu)化及其在探索再生障礙性貧血發(fā)病機制中的應用

  更多相關文章： 人骨髓間充質干細胞 成脂誘導 PPARγ 再生障礙性貧血 瘦素 骨髓間充質干細胞 瘦素受體 炎癥因子

【摘要】：背景：間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)是一種具有高度自我更新和多向分化潛能的多能干細胞,其來源廣泛,骨髓、胎盤、臍血等組織中均可以培養(yǎng)出間充質干細胞。由于MSCs在體外擴增迅速,并且可在特定體外培養(yǎng)條件下分化為成骨細胞,軟骨細胞,脂肪細胞等,間充質干細胞已成為組織工程和再生醫(yī)學中理想的種子細胞。不同來源的間充質干細胞生物學特性不盡相同,因此應用于基礎及臨床研究時用途有所差異。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)因更易向成脂分化和研究較為深入,成為脂肪組織再生修復的理想材料。在臨床工作中,軟組織損傷病人常面臨著修復的難題,如燒傷病人、HIV患者通常伴有軟組織萎縮和面部脂質代謝障礙,嚴重影響生活質量。在基礎研究領域,成脂分化也為研究干細胞分化機制提供了良好的模型。由于研究方向廣泛,細胞來源不同,間充質干細胞的成脂誘導方法也各不相同。因而常常導致不同實驗結果間不能相互比較,極大的阻礙了成脂的相關研究。同時,目前常用的成脂誘導體系培養(yǎng)周期較長,浪費了大量的時間和物質成本。因此,有必要深入了解不同成脂誘導方法對人骨髓間充質干細胞特性的影響。本研究旨在比較不同成脂培養(yǎng)體系下人骨髓間充質干細胞的成脂特性,并進一步比較不同成脂誘導體系的成脂效率,為優(yōu)化成脂誘導方法提供實驗依據(jù)。目的：(1)比較人骨髓間充質干細胞在不同成脂誘導條件下的成脂特性；(2)比較不同成脂誘導方法的誘導效率,優(yōu)化成脂誘導方法。方法：(1)采用三種不同成脂誘導體系對人骨髓間充質干細胞進行體外成脂誘導。(2)應用Real-time PCR方法檢測成脂誘導不同時間點處人骨髓間充質干細胞成脂相關基因PPARγ、FABP-4、adiponectin等的表達情況。(3)采用ELISA方法檢測成脂誘導不同時間點處培養(yǎng)上清中adiponectin的分泌量。(4)共聚焦顯微鏡檢測成脂誘導后油紅染色情況。(5)應用Western blot方法檢測成脂過程中PPARγ,C/EBPβ的表達情況。結果：(1)人骨髓間充質干細胞在不同成脂誘導體系下成脂相關基因的表達水平不同。 DIMR組對PPARγ、FABP-4、adiponectin、C/EBPα、LPL的誘導作用高于其余兩組。(2)隨成脂誘導進程,三組adiponectin的分泌量均逐漸上升,DIMR組分泌水平均高于其余兩組。(3)各成脂誘導方法的成脂效率不同。DIMR組可在成脂誘導早期7-8天即可誘導較多脂滴產生。(4)在成脂誘導早期,DIMI組較其他兩組誘導表達更多的PPARy蛋白,但PPARy蛋白表達量并不隨成脂時間延長持續(xù)增加。在DIMR組中PPAR γ表達量并不隨成脂誘導時間逐漸增加。結論：(1)不同成脂誘導體系下,人骨髓間充質干細胞表現(xiàn)出不同的成脂特性。(2)DIMR培養(yǎng)方法有更高的成脂效率,誘導7天即可觀察到脂滴形成,可以此作為成脂誘導的觀測時間點。(3)在DIMR組中PPARy蛋白表達量不能成為檢測成脂誘導效果的良好指標。背景：再生障礙性貧血(aplastic anemia, AA)是由骨髓造血功能衰竭所致的,以全血細胞減少為特征的疾病,其病理機制復雜。大量的實驗室和臨床數(shù)據(jù)表明免疫功能異常介導的造血抑制在獲得性再障的病理機制中發(fā)揮重要作用。然而,很多相關研究也證實,再障患者的骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)存在著明顯缺陷和異常,如增殖受抑制,造血支持能力下降,免疫抑制能力降低等,這將使他們更易發(fā)生骨髓衰竭。因此,再障患者骨髓間充質干細胞的功能異常將可能會參與其發(fā)病。瘦素(Leptin)是一種主要由白色脂肪細胞分泌的生物活性分子。它不僅具有調解能量代謝、免疫等功能,還是一種促炎癥因子。leptin可促進T淋巴細胞向Th1方向極化。有研究證實它可以參與一些自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展,如類風濕性關節(jié)炎,多發(fā)性硬化等。在血液系統(tǒng)疾病中研究發(fā)現(xiàn),急性淋巴細胞白血病與急性粒細胞白血病患者骨髓中也高表達瘦素。目前對于瘦素與再障發(fā)病的相關性并無研究,因此我們初步探索了瘦素在再障患者骨髓中的含量及與骨髓間充質干細胞的聯(lián)系。本文通過檢測AA患者骨髓漿、骨髓間充質干細胞leptin水平,檢測炎癥因子對骨髓間充質干細胞leptin表達的影響,探討AA患者BM-MSCs對疾病發(fā)生可能存在的新機制。目的：由于瘦素具有明確的免疫調節(jié)功能,通過測定再障患者與正常對照骨髓漿中的含量,推測其與再障發(fā)病是否能具有一定的相關性。進一步檢測再障患者骨髓間充質干細胞的瘦素表達量水平,探討骨髓間充質干細胞在再障發(fā)病中可能存在的新機制。方法：(1)收集再障及正常人骨髓標本,離心收集骨髓漿,ELISA法檢測骨髓漿中瘦素含量；(2)采用貼壁、傳代培養(yǎng)的方法從再障患者和正常人骨髓組織中獲取相對純化的骨髓間充質干細胞；(3)流式細胞儀檢測培養(yǎng)的BM-MSCs表面標志；(4)定向誘導BM-MSCs向成脂分化,比較再障及正常來源BM-MSCs的分化潛能；(5)Real-time PCR法檢測再障及正常來源BM-MSCs中瘦素mRNA表達差異；(6)ELISA法檢測再障及正常來源BM-MSCs體外培養(yǎng)上清中瘦素的分泌量；(7)比較炎癥因子對成脂誘導過程中BM-MSCs產生瘦素的影響。結果：(1)再障患者骨髓漿中瘦素水平高于正常對照。(2)再障患者來源BM-MSCs在轉錄水平表達更多瘦素,體外培養(yǎng)上清中分泌的瘦素水平也顯著高于對照組。(3)炎癥因子可以抑制BM-MSCs向成脂分化,但在長期成脂過程中可促進其分泌更多的瘦素。(4)再障來源BM-MSCs更易向成脂分化。(5)再障患者來源BM-MSCs在轉錄水平表達更多瘦素受體。結論：(1)再障患者骨髓漿表達更高瘦素水平。(2)再障患者BM-MSCs表達更高瘦素水平,可能是導致骨髓漿中瘦素水平上升的原因。(3)炎癥因子可能是導致BM-MSCs分泌更多的瘦素的原因。(4)再障來源BM-MSCs表達更高的瘦素受體水平,可能是導致骨髓脂肪化的一種機制。
【關鍵詞】：人骨髓間充質干細胞 成脂誘導 PPARγ 再生障礙性貧血 瘦素 骨髓間充質干細胞 瘦素受體 炎癥因子
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R556.5
【目錄】：

• 第一部分 人骨髓間充質干細胞成脂誘導方法的優(yōu)化4-36
• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-10
• 材料和方法10-20
• 結果20-27
• 討論27-30
• 結論30-31
• 參考文獻31-36
• 第二部分 再障患者來源骨髓間充質干細胞瘦素及其受體的表達36-58
• 摘要36-38
• Abstract38-40
• 前言40-42
• 材料和方法42-45
• 結果45-50
• 討論50-53
• 結論53-54
• 參考文獻54-58
• 附錄一 主要實驗儀器和試劑58-62
• 附錄二 主要溶液的配置62-65
• 附錄三 英文縮寫和代碼65-67
• 附錄四 在讀期間發(fā)表文章、參加會議67-68
• 致謝68-69

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本文編號：949849