本文關(guān)鍵詞：Compound K對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響及初步機(jī)制研究

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【摘要】：動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的心血管疾病嚴(yán)重地影響著人類(lèi)生命健康�，F(xiàn)有的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物主要是一些以降血脂為主要目的的藥物,例如貝特類(lèi)、他汀類(lèi)、膽汁酸隔離劑、煙酸類(lèi)等,然而因貝特類(lèi)、膽汁酸隔離劑和煙酸類(lèi)藥物易產(chǎn)生嚴(yán)重胃腸道不適、肝腎功能損害等副反應(yīng),且存在選擇性低、易耐受等局限性,所以現(xiàn)已較少使用。目前使用最廣泛的抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物是他汀類(lèi)藥物,但其也具有肌肉疼痛、肝臟毒性等副作用。且在已經(jīng)廣泛使用他汀類(lèi)藥物防治動(dòng)脈粥樣硬化的情況下,動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的心血管疾病發(fā)病率仍居高不下,提示除高血脂外,仍可能存在其他危險(xiǎn)因素。炎癥免疫因素在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中具有重要作用是近年來(lái)的最重要進(jìn)展之一。本實(shí)驗(yàn)室前期在多種動(dòng)物模型的研究證明持續(xù)炎癥刺激能夠使動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病提前、病變加重及斑塊不穩(wěn)定性增加,而抗炎治療則能明顯減輕動(dòng)脈粥樣硬化形成;與此同時(shí)我們觀察到多種細(xì)胞因子如IL-1可促使白細(xì)胞黏附至內(nèi)皮細(xì)胞,IL-18上調(diào)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子、血管細(xì)胞黏附分子的表達(dá),進(jìn)而與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病有密切關(guān)系。近年有研究發(fā)現(xiàn)NOD樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein-3,NLRP3)炎癥小體在被多種刺激因素激活后,能切割I(lǐng)L-1β和IL-18的前體,使IL-1β和IL-18成熟并釋放到胞外從而引起炎癥反應(yīng)。且相較其他亞家族成員而言,NLRP3炎癥小體在血管平滑肌細(xì)胞中是最主要的導(dǎo)致成熟IL-1β釋放的因素,因此抑制NLRP3炎癥小體活性極有可能減輕動(dòng)脈粥樣硬化形成。上述分析提示,從調(diào)節(jié)血脂和降低炎癥反應(yīng)兩個(gè)方面同時(shí)采取干預(yù)措施將極有望成為防治動(dòng)脈粥樣硬化的新策略。本實(shí)驗(yàn)室既往研究還發(fā)現(xiàn),作為三七的主要有效部位的三七總皂苷(panax notoginseng Saponins,PNS),其良好防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用與其抗炎作用密切相關(guān);我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示,作為PNS體內(nèi)代謝活性成分的Compound K(CK,20-O-b-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol)是,具有良好的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用;且PNS減少泡沫細(xì)胞形成的作用與其增加LXRα下游靶基因ABCA1的表達(dá)水平有關(guān),而且可以通過(guò)增加LXRα表達(dá)從而減少大鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成;但其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的系統(tǒng)影響和作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。為此,本課題擬系統(tǒng)探討CK對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響,并從膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(Reverse cholesterol transport,RCT)過(guò)程和NLRP3炎癥小體活性?xún)蓚�(gè)方面對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探索。旨在進(jìn)一步深化對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí),并為CK的成藥性研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理:雄性C57BL/6 apo E-/-小鼠42只,8周齡,在SPF級(jí)房間內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,被隨機(jī)分成7組(n=6),除對(duì)照組采用基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)外,其余均進(jìn)行高脂飲食。每天進(jìn)行腹腔注射給藥一次,持續(xù)12周。給藥情況如下:對(duì)照組給予20ml/kg生理鹽水;模型組在高脂飲食情況下給予20ml/kg生理鹽水;第3、4、5組分別給予1、3、9mg/kg的CK;GGPP組為3mg/kg CK和9mg/kg GGPP混合給藥;阿托伐他汀組劑量為2.6mg/kg。期間每周監(jiān)測(cè)并記錄一次小鼠體重變化情況,12周后取材。2.將主動(dòng)脈竇進(jìn)行固定和包埋后進(jìn)行切片,然后作HE染色,倒置顯微鏡下觀察樣品并拍照,進(jìn)行組織學(xué)分析。冰凍病理切片方法用于處理小鼠肝臟組織,然后進(jìn)行油紅“O”染色,光鏡下觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況,并用Nis-Elements BR 3.2軟件進(jìn)行圖像分析處理。3.對(duì)各組小鼠進(jìn)行摘眼球取血,每只小鼠約取500μl的血樣,立即于4℃離心10min,3000rpm.然后各取200μl上清用AU-2700自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血脂指標(biāo)檢測(cè)。4.獲取每只小鼠200μl左右的血清,按照Millpex catalog ID試劑盒步驟,對(duì)其中具有代表性的炎癥因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)進(jìn)行表達(dá)水平檢測(cè)。5.提取小鼠動(dòng)脈、小腸和肝臟蛋白,檢測(cè)動(dòng)脈中LXRα、ABCA1、ABCG1;小腸ABCG5、ABCG8和肝臟SREBP-1c表達(dá)情況。6.提取動(dòng)脈和肝臟組織的蛋白,用Western blot方法進(jìn)行目標(biāo)蛋白NLRP3,Caspase-1及IL-1β等的表達(dá)水平檢測(cè)。7.培養(yǎng)C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞,按如下分組給藥操作:對(duì)照組、ox-LDL(100μg/ml)模型組、低劑量CK組(ox-LDL+3.3μM CK)、中劑量CK組(ox-LDL+10μM CK)、高劑量CK組(ox-LDL+30μM CK)、CK+GGPP組(ox-LDL+10μM CK+10μM GGPP)、GW3965組(ox-LDL+10μM GW3965),培養(yǎng)24h,檢測(cè)泡沫細(xì)胞中膽固醇含量。8.提取C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞總蛋白,檢測(cè)ABCA1蛋白表達(dá)情況。9.對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用PMA誘導(dǎo)24h使其形成貼壁巨噬細(xì)胞后按如下分組處理:對(duì)照組、膽固醇(1μg/L)模型組、高劑量GW3965組(膽固醇+30μM GW3965)、中劑量GW3965組(膽固醇+10μM GW3965)、低劑量GW3965組(膽固醇+3.3μM GW3965)、GW3965+GGPP組(10μM GW3965+10μM GGPP)、GGPP組(10μM GGPP)、ABCA1antibody組(10μM GW3965+1:200 ABCA1antibody)、apo E組(10μM GW3965+1:200 apo E antibody)。另外,將誘導(dǎo)成功的巨噬細(xì)胞用于檢測(cè)LPS的作用,即取100ng/ml LPS作LPS模型組,其余分組為在LPS模型基礎(chǔ)上給予與上述一致的藥物。提取總RNA和總蛋白,檢測(cè)NLRP3、Caspase-1、IL-1β等表達(dá)。10.培養(yǎng)C57BL/6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞,分組和給藥方式同上所述。提取總蛋白,檢測(cè)NLRP3、Caspase-1和IL-1β等表達(dá)變化情況。結(jié)果:1.對(duì)apo E-/-小鼠動(dòng)脈進(jìn)行切片及HE染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),對(duì)照組動(dòng)物主動(dòng)脈無(wú)可見(jiàn)粥樣硬化斑塊,模型組小鼠主動(dòng)脈則有明顯的病變出現(xiàn),病變面積達(dá)15.05±1.97%,3mg/kg和9mg/kg組動(dòng)物主動(dòng)脈中斑塊面積都顯著下降為6.58±1.09%和2.16±0.62%。2.光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)油紅“O”染色的模型組小鼠肝臟有大量脂滴沉積在肝臟中,陽(yáng)性染色面積比為32.00±4.91%;分別給予3mg/kg和9mg/kg的CK處理后,肝臟內(nèi)脂滴明顯減少,陽(yáng)性面積比分別為11.85±2.40%和4.07±0.76%;同樣地,阿托伐他汀組脂沉積也顯著減少,為4.39±1.08%;GGPP組與模型組相比,無(wú)明顯差異。3.模型組apo E-/-小鼠的血清TC,TG,LDL和HDL水平較對(duì)照組有顯著增加;阿托伐他汀能明顯下調(diào)TC和LDL水平;與模型組比較,所有CK組的TC和TG水平均無(wú)明顯變化,然而3mg/kg CK組和9mg/kg CK組的LDL水平均明顯降低,HDL水平明顯升高;GGPP組較模型組無(wú)顯著變化。4.泡沫細(xì)胞結(jié)果顯示,與模型組相比,CK可以劑量依賴(lài)性地減少泡沫細(xì)胞中膽固醇的沉積,GGPP能夠抑制CK的作用從而使泡沫細(xì)胞中膽固醇含量增多,GW3965作為CK的陽(yáng)性對(duì)照藥,也能顯著地降低泡沫細(xì)胞生成。5.在動(dòng)物和細(xì)胞兩個(gè)水平上CK能劑量依賴(lài)地增加LXRα,ABCA1及ABCG1等蛋白的表達(dá)水平。6.LXRα激動(dòng)劑GW3965能夠劑量依賴(lài)性地降低NLRP3和Caspase-1的m RNA水平(p0.05)和蛋白(p0.05)水平,進(jìn)而降低成熟IL-1β的產(chǎn)生,GGPP作為L(zhǎng)XRα抑制劑能夠顯著抑制GW3965的活性。7.與對(duì)照組相比,高脂飲食的模型組中血清炎癥因子IL-1β,IL-6和TNF-α表達(dá)水平顯著增高;9mg/kg和3mg/kg的CK能顯著下調(diào)其水平(p0.05);阿托伐他汀僅能減少I(mǎi)L-1β和TNF-α的表達(dá)(p0.05),而對(duì)IL-6水平無(wú)顯著影響;GGPP能明顯抑制CK的作用。8.CK在動(dòng)物和細(xì)胞兩個(gè)水平上能劑量依賴(lài)性地減少NLRP3,Caspase-1及IL-1β的表達(dá),且GGPP能顯著抑制其作用。結(jié)論:1.CK能夠顯著抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成,且能減少肝臟中脂質(zhì)的沉積。2.CK抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用與促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)和抑制NLRP3炎癥小體活性有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：組分K 動(dòng)脈粥樣硬化 GW3965 肝X受體α 膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn) NLRP3炎癥小體
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R543.5
【目錄】：

• 縮寫(xiě)詞表5-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-16
• 第一章 前言16-18
• 第二章 Compound K對(duì)apo E-/-小鼠主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響18-30
• 2.1 材料與方法18-22
• 2.2 結(jié)果22-28
• 2.3 討論28-29
• 2.4 小結(jié)29-30
• 第三章 Compound K抑制apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成的初步機(jī)制研究30-63
• 3.1 Compound K抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成與激活LXRα 有關(guān)30-37
• 3.1.1 材料與方法31-36
• 3.1.2 結(jié)果36-37
• 3.2 Compound K抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用與促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)37-41
• 3.2.1 材料與方法37-39
• 3.2.2 結(jié)果39-41
• 3.3 Compound K能夠降低病變局部NLRP3炎癥小體活性41-59
• 3.3.1 材料與方法42-47
• 3.3.2 結(jié)果47-59
• 3.4 討論59-62
• 3.5 小結(jié)62-63
• 全文結(jié)論63
• 特色與展望63-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 文獻(xiàn)綜述 NLRP3炎癥小體與動(dòng)脈粥樣硬化69-79
• 參考文獻(xiàn)74-79
• 在讀碩士期間發(fā)表論文79-80
• 致謝80

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 于兆慧;人參稀有皂苷Compound K的酶法制備及其混合膠束的研究[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2015年

2 周麗;Compound K對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響及初步機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：934867