本文關(guān)鍵詞：UCP2在硫酸吲哚酚誘導心肌細胞肥大中的作用和機制研究

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【摘要】：心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)患者最常見的并發(fā)癥和首位死亡原因。隨著透析技術(shù)的提高,尿毒癥患者的生存時間得以延長,但與此同時心臟暴露于尿毒癥狀態(tài)的時間也相應延長。因此明確尿毒癥狀態(tài)下CVD的發(fā)病機制及干預措施已成為當前腎病領(lǐng)域需要重點關(guān)注的問題。心肌肥厚是CKD患者最常見的心臟病理改變,也是心衰及心臟猝死發(fā)生的重要原因,但其具體發(fā)病機制目前還不清楚。既往的研究認為高血壓、貧血、高容量負荷等因素與CKD狀態(tài)下左室肥厚(Left ventricular hypertrophy,LVH)的發(fā)病有關(guān)。但是,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),上述傳統(tǒng)危險因素不足以解釋CKD狀態(tài)下LVH的高發(fā)病率,有學者認為尿毒癥毒素可能是CKD患者CVD高發(fā)病率的重要原因。因此,從分子或細胞水平探討尿毒素心血管損害的具體機制,并以此為基礎(chǔ)尋找有效干預措施將具有非常重要的意義。硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate,IS)是一種小分子尿毒癥毒素,正常人體內(nèi)含量低于0.1-2.39μM,但由于其親蛋白特性,傳統(tǒng)透析很難將其清除,隨著CKD患者病情進展,血清IS水平甚至可高達500μM以上。研究表明,IS在腎臟纖維化、血管平滑肌細胞增殖及內(nèi)皮功能紊亂中均發(fā)揮重要作用,而且CKD患者血清IS水平與其CVD的發(fā)病率及死亡風險呈正相關(guān)。另外,有報道證實LVH主要發(fā)生于CKD的3,4期并隨CKD的惡化而加重,而IS恰好也在CKD3期開始升高,這就提示IS可能與CKD患者LVH的發(fā)生相關(guān)。此外,新近多項研究及我們課題組的研究發(fā)現(xiàn)IS可以通過促進氧化應激誘導心肌細胞肥大,但是,IS促進氧化應激和誘導心肌細胞肥大的具體機制仍不明確。解偶聯(lián)蛋白(Uncoupling protein,UCP)是一類位于線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子轉(zhuǎn)運蛋白,可通過改變線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子梯度參與能量代謝過程。目前已發(fā)現(xiàn)5種UCPs同系物,其中UCP2廣泛表達于哺乳動物心、腎、肝等多種組織器官,可通過降低線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的跨膜質(zhì)子梯度減少三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)的合成。此外,UCP2還參與細胞活性氧(Reactive oxidative species,ROS)生成、胰島素分泌等多種生理過程。既往研究提示ucp2可以通過抑制氧化應激,調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子濃度等途徑減少心肌細胞凋亡、保護血管內(nèi)皮、防止動脈硬化斑塊形成�；谀壳耙延械难芯窟M展,人們發(fā)現(xiàn)ucp2主要在能量代謝異常和對抗氧自由基損傷方面發(fā)揮著重要作用,然而這類結(jié)果主要源于糖尿病、維生素d缺乏癥等代謝性疾病的研究,ucp2在尿毒素誘導的氧化應激和心肌肥大中的作用及機制國內(nèi)外尚無文獻報道。所以,我們擬在前期研究基礎(chǔ)上進一步明確ucp2是否在is促進氧化應激和誘導心肌細胞肥大過程中發(fā)揮了重要作用。腺苷酸活化蛋白激酶(ampactivatedproteinkinase,ampk)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,廣泛表達于人體各組織,在心臟尤為豐富。既往的研究表明,ampk激活后可以上調(diào)ucp2,減少能量消耗,對抗氧化應激,發(fā)揮積極的心血管保護作用。最近多項研究發(fā)現(xiàn),ampk激動劑5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸轉(zhuǎn)甲酰酶(amino-imidazolecarboxamideribonucleotide,aicar)及二甲雙胍等可以通過激活ampk抑制心肌細胞肥大。因此,ampk調(diào)控ucp2的這種上下游關(guān)系是否參與了is誘導的心肌細胞肥大亦成為本課題研究的一個關(guān)鍵內(nèi)容。為此,本研究以體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞為研究對象,以is為主要處理因素,通過慢病毒轉(zhuǎn)染、免疫熒光組織化學染色、westernblot、核素示蹤、realtimepcr等多種技術(shù),對ucp2在is誘導心肌細胞肥大中的作用及其機制進行了探討。我們的研究分為以下三個部分:(1)觀察is對大鼠心肌細胞ros生成及細胞肥大的影響;(2)觀察is對心肌細胞ucp2表達的影響,并通過制備ucp2慢病毒顆粒,轉(zhuǎn)染心肌細胞,觀察ucp2過表達對is誘導心肌細胞ros生成的影響;(3)通過激活/抑制ampk的活性,明確ampk調(diào)控ucp2在is誘導ros產(chǎn)生及促進心肌細胞肥大中的作用。最終闡明ucp2在is誘導心肌細胞肥大中的作用和分子機制。主要研究結(jié)果及結(jié)論如下:一、is促進ros過量生成并誘導心肌細胞肥大:與對照組相比,is處理組心肌細胞ros生成明顯增多,且存在劑量依賴性;另外,我們發(fā)現(xiàn)500μmis處理48h后,心肌細胞的體積、蛋白合成速率及心房利鈉肽(atrialnatriureticfactor,anf)、腦鈉肽(brainnatriureticpeptide,bnp)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosinheavychain,β-mhc)mrna表達水平較對照組明顯增加,提示is可以促進ros過量生成并誘導心肌細胞肥大。二、is可以下調(diào)心肌細胞ucp2表達:用500μmis作用心肌細胞,隨著作用時間的延長,心肌細胞ucp2蛋白水平逐漸下降。之后再用不同濃度的is作用心肌細胞1h,發(fā)現(xiàn)UCP2表達水平亦呈下降趨勢,提示IS可以下調(diào)心肌細胞內(nèi)UCP2蛋白表達水平,并呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。三、UCP2過表達可以抑制IS誘導的ROS生成:首先用重組UCP2慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染心肌細胞,繼而觀察UCP2過表達對IS誘導心肌細胞ROS生成的影響。我們發(fā)現(xiàn)與IS及IS+空載體組相比,IS+UCP2過表達組ROS生成明顯減少,提示IS通過下調(diào)UCP2表達促進ROS生成,而上調(diào)UCP2表達則可以抑制IS誘導的ROS生成。四、AMPK激活可以抑制IS誘導的UCP2下調(diào)及ROS生成:我們用500μM IS處理心肌細胞不同時間后發(fā)現(xiàn)AMPK磷酸化水平明顯下降,同時AMPK激活劑AICAR預孵育可以抑制IS誘導的UCP2下調(diào),提示IS下調(diào)UCP2蛋白表達與其抑制AMPK激活有關(guān)。另外,與IS組相比,ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)孵育組及AICAR預孵育組ROS生成量明顯減少。提示IS可能通過抑制AMPK激活下調(diào)UCP2表達,進而導致心肌細胞內(nèi)ROS過量生成。五、AMPK激活或UCP2過表達可以拮抗IS誘導的心肌細胞肥大:以細胞體積、蛋白合成速率及ANF、BNP、β-MHC mRNA表達水平作為心肌細胞肥大的觀察指標,觀察AMPK激活及UCP2過表達對IS誘導的心肌細胞肥大的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與單純IS處理組相比,UCP2過表達組及AICAR預孵育組心肌細胞體積較小、蛋白合成速率較慢、ANF、BNP、β-MHC的mRNA表達水平較低。提示AMPK激活或UCP2過表達可以拮抗IS誘導的心肌細胞肥大。綜上所述,我們的課題研究表明,IS可以通過抑制AMPK激活下調(diào)心肌細胞UCP2的表達,從而誘導ROS過量生成,導致心肌細胞肥大的發(fā)生,而UCP2過表達或AMPK激活可以明顯拮抗IS誘導的心肌細胞肥大。提示IS誘導心肌細胞肥大可能與AMPK/UCP2/ROS信號通路有關(guān)。通過我們的研究,不僅進一步證實了尿毒癥毒素在CKD患者心肌肥厚中的重要作用,也從一定程度闡明了IS誘導心肌細胞肥大的發(fā)生機理,為臨床預防及治療尿毒癥心肌病提供了更充足可靠的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：解偶聯(lián)蛋白2 硫酸吲哚酚 AMPK 尿毒癥心肌病 氧化應激
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R54
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• Abstract6-10
• 中文摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 IS誘導心肌細胞肥大的作用及機制研究15-30
• 2.1 實驗材料15-17
• 2.2 實驗方法17-22
• 2.3 結(jié)果22-28
• 2.4 討論28-29
• 2.5 小結(jié)29-30
• 第三章 UCP2過表達可抑制IS誘導的氧化應激30-41
• 3.1 實驗材料30-32
• 3.2 實驗方法32-35
• 3.3 結(jié)果35-39
• 3.4 討論39-40
• 3.5 小結(jié)40-41
• 第四章 AMPK激活或UCP2過表達可抑制IS誘導的心肌細胞肥大41-53
• 4.1 實驗材料41-44
• 4.2 實驗方法44
• 4.3 結(jié)果44-51
• 4.4 討論51-52
• 4.5 小結(jié)52-53
• 全文總結(jié)53-54
• 參考文獻54-61
• 文獻綜述 解耦聯(lián)蛋白2在心血管疾病中的研究進展61-71
• 參考文獻66-71
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文及成果71-72
• 致謝72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 徐新麗;楊可;管旭;肖堂利;何婷;余彥琳;劉亮;趙景宏;;UCP2在硫酸吲哚酚誘導心肌細胞肥大中的作用[J];第三軍醫(yī)大學學報;2014年22期

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本文編號：901174