本文關(guān)鍵詞：心肌缺氧復(fù)氧損傷中轉(zhuǎn)錄因子FoxO4對自噬的影響

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【摘要】：目的:觀察心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)損傷情況下轉(zhuǎn)錄因子Fox O4對細(xì)胞內(nèi)過度自噬的影響,探討其可能的機(jī)制,從而揭示轉(zhuǎn)錄因子Fox O4在心肌細(xì)胞H/R損傷情況下的作用。方法:1)以SD大鼠原代心肌細(xì)胞為研究對象,取出生1-3天的SD大鼠乳鼠心臟制備原代心肌細(xì)胞2)分別缺氧1h、3h、6h、8h、12h、14h、24h,復(fù)氧0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h,通過western blot檢測LC3蛋白表達(dá)和乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測,選擇出合適的缺氧和復(fù)氧時間點(diǎn),建立缺氧復(fù)氧模型。3)確定好缺氧復(fù)氧條件在缺氧1h及復(fù)氧6h兩個時間點(diǎn)上進(jìn)行后,設(shè)立5個實(shí)驗(yàn)組:a)對照組:正常培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞;b)H/R組:原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)5天后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理;c)H/R+陰性干擾病毒組:原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)2天后,轉(zhuǎn)染陰性干擾病毒,轉(zhuǎn)染3天后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理;d)H/R+空載病毒組:原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)2天后,轉(zhuǎn)染空載病毒,轉(zhuǎn)染3天后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理;e)H/R+FoxO4-RNAi組:原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)2天后,轉(zhuǎn)染Fox O4-RNAi病毒,轉(zhuǎn)染3天后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理;f)H/R+Fox O4組:原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)2天后,轉(zhuǎn)染過表達(dá)FoxO4病毒,轉(zhuǎn)染3天后進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理。4)通過Western blo檢測各組Fox O4、LC3、p62蛋白表達(dá)情況,并檢測各組LDH活性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(sx±)表示,通過統(tǒng)計軟件IBM SPSS Statistics 20進(jìn)行t檢驗(yàn),結(jié)果以p0.05認(rèn)為有顯著性差異。結(jié)果:1)心肌細(xì)胞經(jīng)缺氧處理1h、3h、6h、8h、12h、14h、24h后,與正常對照組相比,LC3蛋白表達(dá)均有升高,在1h上升最明顯(p0.05);上清中LDH活性均有升高,與正常組相比均有顯著性差異(p0.05)。2)心肌細(xì)胞經(jīng)缺氧1h復(fù)氧0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h,在復(fù)氧6h表達(dá)最明顯(p0.05);上清中LDH活性均有升高,與正常組相比均有顯著性差異(p0.05)。3)分別轉(zhuǎn)染FoxO4-RNAi、FoxO4慢病毒表達(dá)載體72h后,對心肌細(xì)胞進(jìn)行H/R處理。H/R組與正常對照組相比,H/R組的LDH活性有顯著升高(p0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與H/R組相比,H/R+Fox O4組LC3表達(dá)、LDH活性均有顯著升高(p0.05),p62表達(dá)有顯著降低(p0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;H/R+Fox O4-RNAi組LC3表達(dá)、LDH活性均有顯著降低(p0.05),p62表達(dá)有顯著升高(p0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:1)LC3在正常SD大鼠原代心肌細(xì)胞中表達(dá)較低,缺氧復(fù)氧損傷下LC3在心肌細(xì)胞中的表達(dá)增加,在缺氧1h、復(fù)氧6h時表達(dá)增加最為明顯,并以此作為本研究的模型。2)缺氧復(fù)氧損傷后,心肌細(xì)胞內(nèi)自噬過度增強(qiáng),細(xì)胞受損。上調(diào)FoxO4后,心肌細(xì)胞內(nèi)過度自噬進(jìn)一步增強(qiáng),細(xì)胞受損情況加重;下調(diào)Fox O4后,心肌細(xì)胞內(nèi)過度自噬被抑制,細(xì)胞受損情況也得到改善。說明Fox O4參與心肌細(xì)胞的自噬過程,并可以促進(jìn)細(xì)胞自噬。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)錄因子FoxO4 自噬 缺氧復(fù)氧 原代心肌細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R54
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料與方法13-27
• 2.1 材料13-18
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及慢病毒13
• 2.1.2 儀器設(shè)備13-14
• 2.1.3 購置試劑14-15
• 2.1.4 自配試劑15-18
• 2.2 方法18-26
• 2.2.1 相關(guān)實(shí)驗(yàn)器材的滅菌處理18
• 2.2.2 原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及H/R模型的建立18-20
• 2.2.3 原代心肌細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)染20-22
• 2.2.4 實(shí)驗(yàn)分組22-23
• 2.2.5 LDH活性檢測23
• 2.2.6 Western bolt檢測23-26
• 2.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析26-27
• 第3章 結(jié)果27-33
• 3.1 SD大鼠原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)27
• 3.2 H/R條件對原代心肌細(xì)胞活力及自噬的影響27-29
• 3.2.1 缺氧對心肌細(xì)胞活力及自噬的影響27-28
• 3.2.2 缺氧復(fù)氧對心肌細(xì)胞活力及自噬的影響28-29
• 3.3 FoxO4對心肌細(xì)胞H/R損傷后細(xì)胞活力及自噬的影響29-33
• 3.3.1 干擾、過表達(dá)FoxO4慢病毒轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的結(jié)果29-30
• 3.3.2 FoxO4對心肌細(xì)胞H/R損傷后細(xì)胞活力及自噬的影響30-33
• 第4章 討論33-37
• 4.1 原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及缺氧復(fù)氧損傷模型的建立34-35
• 4.2 心肌缺氧復(fù)氧損傷中轉(zhuǎn)錄因子FoxO4對自噬的影響35-37
• 第5章 結(jié)論37-38
• 5.1 結(jié)論37
• 5.2 不足之處與展望37-38
• 致謝38-39
• 參考文獻(xiàn)39-41
• 綜述41-47
• 參考文獻(xiàn)46-47

【參考文獻(xiàn)】

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7 崔e，

本文編號：897523