本文關(guān)鍵詞：激動(dòng)TGR5對(duì)乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白的影響及其機(jī)制

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【摘要】：目的:研究激動(dòng)TGR5對(duì)乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞膠原蛋白分泌的影響,并探討可能存在的機(jī)制。方法:1、原代培養(yǎng)乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞(cfs)及鑒定:取3-5天乳小鼠,處死后取心臟的心尖部分,胰酶消化后用差速貼壁法培養(yǎng)7-10天左右傳代,取3代細(xì)胞用特異性抗體熒光免疫法鑒別。2、熒光定量PCR檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞上TGR5 m RNA表達(dá):提取生長(zhǎng)良好的3代心肌成纖維細(xì)胞的RNA,同時(shí)分別提取肝臟、脾臟和心臟組織的RNA用于對(duì)比,檢測(cè)RNA的濃度及純度后,進(jìn)行c DNA的反轉(zhuǎn)錄合成,委托上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)、合成TGR5引物,上機(jī)進(jìn)行目的基因的定量檢測(cè)。3、TGR5過表達(dá)慢病毒的制備與包裝:利用限制性內(nèi)切酶消化后得到線性化載體。PCR擴(kuò)增制備目的基因片段。以GV358作為工具載體質(zhì)粒,同Helper 1.0質(zhì)粒及Helper 2.0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48-72 h后進(jìn)行病毒收獲,離心濃縮和純化后得到高滴度的慢病毒,分裝保存,并進(jìn)行病毒質(zhì)量檢測(cè)。4、TGR5過表達(dá)慢病毒感染心肌成纖維細(xì)胞,上調(diào)細(xì)胞膜上TGR5表達(dá):取3代生長(zhǎng)良好的心肌成纖維細(xì)胞,分為正常細(xì)胞組、空病毒組、TGR5過表達(dá)慢病毒組(cfs-v),孵育24h,熒光顯微鏡下觀察熒光顯色并用PCR法檢測(cè)細(xì)胞膜上TGR5 m RNA的表達(dá)變化,用Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TGR5的蛋白水平。5、小鼠膠原蛋白酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)膠原蛋白I型和III型:用吸管分別吸取各組培養(yǎng)基于10ml離心管中,離心后得到上清液,加入酶標(biāo)板中,經(jīng)溫育、洗滌、顯色、終止、測(cè)定得到各組OD值用excel、SPSS等軟件分析數(shù)據(jù)。6、c AMP試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)c AMP含量:胰酶消化收集上述各組細(xì)胞,經(jīng)反復(fù)凍存,使細(xì)胞內(nèi)成分完全裂解,離心后取上清液,加入酶標(biāo)板中,經(jīng)溫育、洗滌、加酶、顯色、終止、測(cè)定得到各組OD值用excel、SPSS等軟件分析數(shù)據(jù)。7、探索激動(dòng)TGR5影響膠原蛋白分泌的機(jī)制:實(shí)驗(yàn)分組:(1)空白組(cfs組),(2)對(duì)照組(cfs-v組)(3)cfs-v+nomilin組,(4)cfs-v+nomilin+BIRB-796組。取2代cfs及cfs-v接種于6孔板上,正常培養(yǎng)2天,當(dāng)貼璧細(xì)胞達(dá)到90%時(shí)加入含BIRB-796的培養(yǎng)基(BIRB-796終濃度為10μmol/l)干預(yù)1小時(shí),然后加入諾米林(nomilin)(50mmol/l,20μl/孔)作用24小時(shí)。分別提取上述各組細(xì)胞的總蛋白及核蛋白,運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定得到蛋白濃度,以GAPDH為內(nèi)參,將處理好的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離、轉(zhuǎn)膜、封閉,依次孵育一抗和二抗、顯色、成像后,將獲得圖像用圖像處理軟件Image J測(cè)定并分析條帶灰度值以檢測(cè)p-P38、Nrf2、HO-1的蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1、原代培養(yǎng)乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞成功。2、熒光定量PCR結(jié)果顯示:cfs上TGR5 m RNA的表達(dá)量明顯少于心臟、肝臟和脾臟,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。3、成功制備TGR5過表達(dá)慢病毒:克隆測(cè)序結(jié)果證實(shí)目標(biāo)基因成功連接入酶切載體。檢測(cè)病毒滴度為2E+8TU/ml。4、成功建立過表達(dá)TGR5的心肌成纖維細(xì)胞模型:4.1熒光顯微鏡下可見感染TGR5過表達(dá)慢病毒的心肌成纖維細(xì)胞(cfs-v)有大量熒光表達(dá),感染率為90%。4.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:cfs-v上TGR5 m RNA表達(dá)量較cfs明顯增多,P0.05。4.3 Western Blot結(jié)果顯示:cfs-v內(nèi)TGR5的蛋白含量較cfs明顯增多,P0.05。5、c AMP試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)c AMP含量的結(jié)果顯示:cfs-v+nomilin組細(xì)胞內(nèi)c AMP含量較cfs組及cfs-v組均明顯升高,P值均0.05。6、ELISA試劑盒檢測(cè)膠原蛋白I型和III型的結(jié)果顯示:cfs-v+nomilin組細(xì)胞分泌的I型和III型膠原蛋白較cfs組及cfs-v組均明顯降低,P值均0.05。cfs-v+nomilin+BIRB-796組與cfs-v+nomilin組相比,膠原蛋白I型和III的含量增多,P0.05。7、Western Blot法檢測(cè)各組內(nèi)p-P38、Nrf2及HO-1的蛋白水平,結(jié)果顯示:cfs-v+nomilin組細(xì)胞內(nèi)p-P38、Nrf2及HO-1的蛋白水平較cfs-v組均明顯升高,P值均0.05。cfs-v+nomilin+BIRB-796組的上述三種蛋白含量較cfs-v+nomilin組明顯減少,P均0.05。結(jié)論:1、激動(dòng)TGR5能減少乳小鼠心肌成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白I型和III型。2、TGR5激活后可能通過P38途徑引起Nrf2核轉(zhuǎn)位啟動(dòng)HO-1表達(dá),抑制心肌成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白。3、P38-Nrf2信號(hào)通路可能是TGR5參與抑制心肌纖維化的眾多信號(hào)途徑之一。
【關(guān)鍵詞】：TGR5 膠原蛋白Ⅰ型 膠原蛋白Ⅲ型 心肌成纖維細(xì)胞 P38-MAPK Nrf2 HO-1
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R542.2
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-10
• 前言10-12
• 材料與方法12-34
• 結(jié)果34-48
• 討論48-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 英漢縮略詞對(duì)照表60-61
• 致謝61-62
• TGR5與代謝綜合征 綜述62-72
• 參考文獻(xiàn)67-72

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