本文關(guān)鍵詞：Dasatinib誘導(dǎo)人急性髓性白血病細(xì)胞分化的藥效及其機(jī)制研究

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【摘要】：研究目的： 急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)的重要標(biāo)志是嚴(yán)重的髓系分化障礙,因此誘導(dǎo)分化治療是目前臨床上針對AML的有效治療策略。全反式維甲酸(All-trans retinoic acid, ATRA)是臨床上首個用于治療急性早幼粒白血病(Acute promeyloid leukemia, APL)的誘導(dǎo)分化劑,雖然治療初期療效顯著,然而隨著ATRA的使用,APL患者出現(xiàn)了不同程度的不良反應(yīng)并對ATRA產(chǎn)生了耐受作用。因此,尋找新的高效低毒的誘導(dǎo)分化劑顯得尤為重要。酪氨酸激酶抑制劑近年來引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注和探討,其中多個藥物均被證實可以誘導(dǎo)AML細(xì)胞的分化。達(dá)沙替尼(Dasatinib)是第二代的小分子酪氨酸激酶抑制劑,已有研究表明Dasatinib可以協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞的分化,然而有關(guān)Dasatinib單獨誘導(dǎo)AML細(xì)胞的分化作用及其分子機(jī)制卻很少有被報道。 有文獻(xiàn)報道,STAT1在細(xì)胞隨性分化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,但是,關(guān)于STAT1在Dasatinib誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化中的作用并未見文獻(xiàn)報道。同時,我們在實驗過程中觀察到了Dasatinib可以誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生自噬,已有研究表明細(xì)胞自噬可以影響細(xì)胞分化過程,然而AML細(xì)胞中自噬的發(fā)生與細(xì)胞分化之間的關(guān)系卻未見報道。因此,本課題擬通過實驗方法研究Dasatinib誘導(dǎo)AML細(xì)胞的分化作用,并且進(jìn)一步探索可能存在的分子機(jī)制。 研究方法： 選用人白血病細(xì)胞株HL60和NB4為研究對象,考察Dasatinib對AML細(xì)胞的增殖和周期分布的影響,并檢測Dasatinib誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的能力。采用臺盼蘭拒染法結(jié)合血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)來觀察細(xì)胞增殖情況,描繪細(xì)胞生長曲線；細(xì)胞經(jīng)Annexin V-PI雙染后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況；細(xì)胞經(jīng)PI染色后采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的變化情況；細(xì)胞經(jīng)CD11b-PE抗體結(jié)合后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分化抗原CD11b表達(dá)；應(yīng)用Western blot檢測細(xì)胞凋亡、周期和分化相關(guān)蛋白(PARP、Caspase3、Cleaved-Caspase3、c-Myc、p21、p27、 PU.1、C/EBPβ)的表達(dá)；應(yīng)用硝基四氮唑藍(lán)(NBT)還原實驗檢測細(xì)胞分化能力；應(yīng)用瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；應(yīng)用Real-time PCR檢測細(xì)胞內(nèi)分化相關(guān)因子(PU.1、C/EBPα、C/EBPβ)的mRNA表達(dá)水平；建立人白血病裸小鼠移植瘤模型評價Dasatinib的體內(nèi)藥效； 選用人白血病細(xì)胞株HL60和NB4為研究對象,考察Dasatinib誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的分子機(jī)制。細(xì)胞經(jīng)CDllb-PE抗體結(jié)合后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分化抗原CD11b表達(dá)；細(xì)胞經(jīng)PI染色后采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的變化情況；應(yīng)用NBT還原實驗檢測細(xì)胞分化能力；應(yīng)用瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；應(yīng)用Western blot檢測蛋白(PU.1、p-STAT1(S727)、p38、p-p38、JNK、 p-JNK、RARa、p-STAT1(Y701)、STAT1、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK、AKT、 p-AKT、LC3)的表達(dá)；應(yīng)用Real-time PCR檢測細(xì)胞內(nèi)CXCL-10、RIG-G、IRF-1的mRNA表達(dá)水平；應(yīng)用免疫熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)STAT1的定位變化；應(yīng)用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測細(xì)胞內(nèi)RARa的轉(zhuǎn)錄活性；應(yīng)用丹酰戊二胺(MDC)染色方法檢測細(xì)胞內(nèi)自噬泡的分布情況。 研究結(jié)果： 1)通過臺盼蘭拒染法結(jié)合血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),顯示Dasatinib能顯著抑制HL60細(xì)胞的增殖,并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性和時間依賴性。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況,并用western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示,高濃度Dasatinib均能引起HL60細(xì)胞(30μM)和NB4(20μM)細(xì)胞的凋亡。流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期情況,顯示Dasatinib能使HL60細(xì)胞和NB4細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G1/G0期。人白血病裸小鼠移植瘤模型評價Dasatinib的體內(nèi)藥效,結(jié)果顯示,Dasatinib對AML細(xì)胞的體內(nèi)增殖具有較好的抑制作用。 2)檢測細(xì)胞分化表面抗原標(biāo)記物CDllb的表達(dá),結(jié)果顯示Dasatinib能夠誘導(dǎo)HL60和NB4細(xì)胞發(fā)生分化,且呈時間和濃度依賴性關(guān)系,Dasatinib (10μM作用HL60細(xì)胞72小時后,CD11b陽性率為48%,Dasatinib (5μM)作用NB4細(xì)胞48小時后,CD11b陽性率達(dá)到了49%。瑞氏-吉姆薩的染色結(jié)果表明Dasatinib作用72小時后,HL60細(xì)胞和NB4細(xì)胞發(fā)生了髓系細(xì)胞方向的分化。NBT還原實驗結(jié)果確證了Dasatinib誘導(dǎo)HL60細(xì)胞分化的能力。Real-time PCR以及western blot實驗結(jié)果進(jìn)一步證實了Dasatinib可以激活A(yù)ML細(xì)胞中髓性分化相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄。以上這些實驗結(jié)果都表明Dasatinib可以誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生髓性分化。 3) Western blot結(jié)果表明Dasatinib作用后AML細(xì)胞中RARa的蛋白表達(dá)水平隨時間進(jìn)程明顯下降。采用熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測RARa熒光素酶活性,顯示Dasatinib并不能激活RARa的轉(zhuǎn)錄。采用shRNA技術(shù)沉默HL60細(xì)胞中RARa蛋白的表達(dá),將Dasatinib分別作用轉(zhuǎn)入了空載的HL60細(xì)胞和沉默了RARa的HL60細(xì)胞72小時,流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11b結(jié)果表明,Dasatinib誘導(dǎo)這兩株細(xì)胞分化的能力沒有發(fā)生改變。以上結(jié)果提示我們RARa在Dasatinib誘導(dǎo)的AML細(xì)胞的分化過程中可能沒有發(fā)揮主要作用。 4) Dasatinib作用HL60和NB4細(xì)胞不同時間后,STAT1蛋白的磷酸化水平被明顯上調(diào)。DAPI染色結(jié)合免疫熒光定位結(jié)果顯示,STAT1被磷酸化激活后由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核中,采用Real-time PCR檢測STAT1下游因子CXCL-10、 RIG-G、 IRF-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果證實STAT1發(fā)揮了轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。采用shRNA技術(shù)沉默HL60細(xì)胞中STAT1蛋白的表達(dá),沉默后的HL60細(xì)胞經(jīng)Dasatinib作用72小時后,CDllb陽性率由54%降到了39%,表明Dasatinib誘導(dǎo)的HL60細(xì)胞的分化被抑制,NBT還原實驗和瑞氏-吉姆薩染色實驗均證實了這一結(jié)果。Western blot結(jié)果顯示,在Dasatinib誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的過程中,MEK/ERK蛋白的磷酸化水平明顯上調(diào)。采用MEK抑制劑PD98059和Dasatinib共同作用AML細(xì)胞后(10μM Dasatinib作用HL60細(xì)胞72小時,5μM Dasatinib作用NB4細(xì)胞48小時),細(xì)胞內(nèi)STAT1蛋白的磷酸化水平被明顯下調(diào),同時,流式細(xì)胞術(shù)檢測CDllb的表達(dá),結(jié)果顯示HL60細(xì)胞中CDllb陽性率由單用Dasatinib的50%下降到了合用組的16%,NB4細(xì)胞中CDllb陽性率由單用Dasatinib的57%下降到了合用組的12%。以上結(jié)果提示我們,Dasatinib誘導(dǎo)的AML細(xì)胞的分化作用依賴于MEK/ERK通路調(diào)控的STAT1活性的增加。 5) Dasatinib作用HL60和NB4細(xì)胞0、6、12、24和48小時后,采用western blot檢測了自噬標(biāo)記蛋白LC3的變化,結(jié)果表明LC3Ⅱ蛋白表達(dá)隨時間逐漸增加,光密度分析顯示LC3Ⅱ/Ⅰ比值逐漸升高,作用48小時后差異顯著。采用MDC染色檢測細(xì)胞內(nèi)自噬泡的產(chǎn)生和分布,結(jié)果表明,不論是HL60細(xì)胞還是NB4細(xì)胞中,Dasatinib作用6小時后,部分細(xì)胞內(nèi)即出現(xiàn)示蹤自噬泡的熒光點狀分布,作用12小時后細(xì)胞核周圍區(qū)域大量出現(xiàn)點狀熒光分布,到24小時后更加明顯。通過自噬抑制劑3MA、 Wortmannin和LY294002來下調(diào)AML細(xì)胞中的自噬水平,流式細(xì)胞術(shù)檢測CDllb結(jié)果表明,Dasatinib誘導(dǎo)的AML細(xì)胞的分化也因此被抑制。相應(yīng)地,通過自噬促進(jìn)劑雷帕霉素(Rapamycin)來增加AML細(xì)胞中的自噬水平,Dasatinib誘導(dǎo)的AML細(xì)胞的分化水平則被明顯上調(diào)。將較低濃度的Dasatinib和ATRA同時作用于HL60和NB4細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測CD11b結(jié)果表明,Dasatinib能顯著促進(jìn)ATRA誘導(dǎo)的AML細(xì)胞的分化。采用MDC染色觀察自噬泡的形成,結(jié)果顯示在HL60和NB4細(xì)胞中,Dasatinib和ATRA共同作用的組別自噬泡大量出現(xiàn)并分散在細(xì)胞核周區(qū)域,由此可見,自噬可能參與了Dasatinib協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的過程。以上實驗表明,Dasatinib可以誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生自噬,這種自噬的發(fā)生伴隨著整個髓性分化進(jìn)程而存在,同時這種自噬的發(fā)生有利于AML細(xì)胞的分化。 結(jié)論：本論文較為系統(tǒng)地討論了Dasatinib誘導(dǎo)的AML細(xì)胞的分化作用,并對其中的分子機(jī)制做了初步探討。研究表明Dasatinib可以誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化成為髓系細(xì)胞,并且MEK/ERK依賴性的STAT1的激活以及細(xì)胞內(nèi)自噬水平的上調(diào)都可能有利于分化進(jìn)程。本課題對Dasatinib誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的分子機(jī)制作了全新闡述,為Dasatinib在分化誘導(dǎo)治療上的應(yīng)用提供了實驗依據(jù),也為進(jìn)一步完善和發(fā)展新型的白血病分化誘導(dǎo)治療策略提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：達(dá)沙替尼(Dasatinib) 急性髓性白血病(AML) 細(xì)胞分化 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1) 細(xì)胞自噬
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R733.7
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-10
• Abstract10-15
• 目錄15-17
• 1 引言17-20
• 2 實驗材料與儀器20-24
• 2.1 細(xì)胞株20
• 2.2 實驗動物20
• 2.3 儀器20
• 2.4 藥物與主要試劑20-24
• 3 實驗方法24-33
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)24
• 3.2 臺盼蘭拒染法檢測Dasatinib抑制人白血病細(xì)胞增殖活性24
• 3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測HL60和NB4細(xì)胞凋亡情況24
• 3.4 Western Blot檢測相關(guān)蛋白24-26
• 3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測HL60和NB4細(xì)胞周期的變化26
• 3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測HL60和NB4細(xì)胞表面分化抗原表達(dá)情況26
• 3.7 瑞氏-吉姆薩染色觀察AML細(xì)胞核形態(tài)變化26-27
• 3.8 NBT細(xì)胞還原能力測定27
• 3.9 實時熒光定量PCR測定細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)水平的變化27-29
• 3.10 人白血病裸小鼠移植瘤模型的建立及實驗研究29
• 3.11 雙熒光素酶報告基因檢測29-30
• 3.12 慢病毒顆粒的包裝和細(xì)胞轉(zhuǎn)染30-31
• 3.13 免疫熒光法觀察STAT1在細(xì)胞內(nèi)的定位情況31
• 3.14 丹酰戊二胺(MDC)染色檢測自噬泡分布31-32
• 3.15 數(shù)據(jù)分析32-33
• 4 實驗結(jié)果33-69
• 4.1 Dasatinib可以抑制AML細(xì)胞的增殖33-35
• 4.2 Dasatinib對AML細(xì)胞具有周期阻滯作用35-37
• 4.3 Dasatinib可以誘導(dǎo)AML細(xì)胞的髓性分化37-43
• 4.4 Dasatinib在體內(nèi)可以抑制AML細(xì)胞的增殖43-45
• 4.5 RARa在Dasatinib誘導(dǎo)的AML細(xì)胞的分化過程中沒有發(fā)揮主要作用45-48
• 4.6 Dasatinib通過激活STAT1誘導(dǎo)AML細(xì)胞的髓性分化48-57
• 4.6.1 Dasatinib增強(qiáng)了STAT1的活性48-50
• 4.6.2 STAT1蛋白水平的下降抑制了Dasatinib誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的能力50-52
• 4.6.3 Dasatinib通過激活MEK/ERK的磷酸化增強(qiáng)STAT1的活性52-57
• 4.7 Dasatinib誘導(dǎo)的自噬可以促進(jìn)AML細(xì)胞的髓性分化57-69
• 4.7.1 Dasatinib誘導(dǎo)AML細(xì)胞發(fā)生自噬57-59
• 4.7.2 細(xì)胞自噬水平的下調(diào)抑制Dasatinib誘導(dǎo)的細(xì)胞分化59-64
• 4.7.3 上調(diào)細(xì)胞的自噬水平可以協(xié)同增強(qiáng)Dasatinib的誘導(dǎo)分化作用64-66
• 4.7.4 自噬可能參與了Dasatinib協(xié)同ATRA誘導(dǎo)AML細(xì)胞分化的過程66-69
• 5 討論69-73
• 參考文獻(xiàn)73-78
• 綜述78-90
• 參考文獻(xiàn)85-90
• 作者簡介及碩士期間論文和會議摘要90-91

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 鐘里科;Dasatinib誘導(dǎo)人急性髓性白血病細(xì)胞分化的藥效及其機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2013年

2 薛濤;酪氨酸激酶抑制劑達(dá)沙替尼與吉非替尼的肝臟毒性及其機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2012年

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本文編號：845394