本文關(guān)鍵詞：匹伐他汀納米顆粒改善內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能及修復(fù)損傷血管研究

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【摘要】：研究背景與目的血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化性疾病和介入治療術(shù)后再狹窄的主要病理生理基礎(chǔ),因此,如何促進(jìn)內(nèi)皮的有效修復(fù)和再生是此類疾病良性轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵。近年來,內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell,EPC)在損傷血管修復(fù)、缺血組織血管新生、正常內(nèi)皮功能維持中的作用已引起廣泛關(guān)注。但是在心血管疾病及其相關(guān)危險(xiǎn)因素患者中,EPC數(shù)量減少且功能下降,修復(fù)損傷血管的能力下降,因此應(yīng)用藥物或其它干預(yù)因素增加EPC的數(shù)量并改善其功能是優(yōu)化EPC治療策略的重要手段。他汀類藥物作為缺血性心血管疾病治療的基石,具有獨(dú)立于降脂以外的多重心血管保護(hù)作用,其中包括對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能的改善,但這種作用多建立在較大劑量、長時(shí)間他汀類藥物的應(yīng)用上。作為新一代的他汀藥物,匹伐他汀已被證實(shí)具有更強(qiáng)的調(diào)脂、改善內(nèi)皮功能、逆轉(zhuǎn)斑塊等治療價(jià)值,但是為達(dá)到這種獲益所需局部藥物濃度較高、服用時(shí)間較長,仍可引起全身不良反應(yīng)。納米技術(shù)的出現(xiàn)為藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)提供了新的平臺(tái),以可生物降解的高分子材料做為藥物載體,可改變其包裹藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特征,達(dá)到提高療效、減輕不良反應(yīng)等作用。近年來匹伐他汀納米顆粒在促進(jìn)缺血組織血管新生、逆轉(zhuǎn)/穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊及防治肺動(dòng)脈高壓中已顯示出巨大優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)旨在制備匹伐他汀納米顆粒,觀察匹伐他汀納米顆粒對(duì)EPC生物學(xué)功能的影響,并對(duì)其增殖機(jī)制作初步探討;在體研究內(nèi)吞匹伐他汀納米顆粒后EPC修復(fù)損傷血管功能。方法1.匹伐他汀納米顆粒的制備及性質(zhì)表征研究以聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)為載體,匹伐他汀為包裹藥物,采用超聲乳化溶劑揮發(fā)法制備,電鏡觀察納米顆粒形貌,納米粒度儀測(cè)定其粒徑及分布情況。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)計(jì)算載藥量和包封率,藥物釋放實(shí)驗(yàn)觀察納米顆粒的釋藥特點(diǎn)。2.大鼠脾源性EPC培養(yǎng)、鑒定密度梯度離心法獲得大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞,在添加胎牛血清、血管內(nèi)皮生長因子的DMEM低糖培養(yǎng)基中培養(yǎng),顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。Di I-ac LDL攝取與FITC-UEA-I結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定EPC是否具有內(nèi)皮細(xì)胞的特性,流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原和干細(xì)胞抗原。3.內(nèi)皮祖細(xì)胞攝取納米顆粒的研究以FITC為熒光探針,制備載FITC-PLGA納米顆粒,與內(nèi)皮祖細(xì)胞共孵育后,激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞攝取納米顆粒情況。4.載體材料PLGA對(duì)EPC活性的影響取培養(yǎng)7天的EPC,予不同濃度空白PLGA納米粒懸液(5、25、50、100、200μg/m L)處理,CCK8法檢測(cè)空白PLGA納米顆粒對(duì)EPC活性影響。5.觀察匹伐他汀納米顆粒對(duì)EPC生物學(xué)功能的影響取培養(yǎng)7天的EPC,予匹伐他汀納米顆粒(含匹伐他汀濃度分別為0.001μM、0.01μM、0.1μM)培養(yǎng)24h后換新鮮培養(yǎng)基,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、空白納米顆粒組、匹伐他汀原藥組(0.001μM、0.01μM、0.1μM)。培養(yǎng)3天后,CCK8法、Transwell小室、人工計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)EPC增殖、遷移、粘附、凋亡功能。6.探討PI3K/Akt信號(hào)通路在匹伐他汀納米顆粒介導(dǎo)EPC增殖中的作用取培養(yǎng)7天的EPC,給予PI3K信號(hào)通路抑制劑LY294002預(yù)處理,觀察其在匹伐他汀納米顆粒介導(dǎo)EPC增殖中的作用,western blot檢測(cè)匹伐他汀納米顆粒對(duì)EPC Akt蛋白磷酸化的影響。7.匹伐他汀納米顆粒干預(yù)后EPC修復(fù)損傷血管的研究建立大鼠頸動(dòng)脈損傷模型,熒光標(biāo)記各組EPC并經(jīng)尾靜脈注射。術(shù)后3天,熒光顯微鏡觀察損傷血管EPC歸巢情況,及其是否具備內(nèi)皮細(xì)胞表型;術(shù)后7天,伊文氏蘭染色評(píng)價(jià)損傷血管再內(nèi)皮化;術(shù)后14天,HE染色后評(píng)估內(nèi)膜增生情況。結(jié)果1.乳化法制備匹伐他汀納米顆粒呈圓球形,外表光滑,平均粒徑230.1±45nm(n=3)。載藥量為(10.00±1.83)%(n=3),包封率為(35.54±5.40)%(n=3)。體外釋放藥物實(shí)驗(yàn)顯示納米顆粒具有緩釋特性,2周累積釋放量為(83.20±5.63)%(n=3)。2.脾源性EPC培養(yǎng)和鑒定培養(yǎng)7天的貼壁細(xì)胞,予Di I-ac LDL和FITC-UEA-I染色。激光共聚焦顯微鏡下觀察,Di I-ac LDL陽性染色呈紅色,FITC-UEA-I陽性染色呈綠色,雙染陽性呈黃色,為正在分化的EPC,雙染陽性率為87.25±2.03%(n=3);流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原VEGFR-2陽性率79.00±5.21%,干細(xì)胞抗原CD34陽性率為80.07±4.70%(n=3)。3.內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取FITC納米顆粒懸液與EPC共培養(yǎng),激光共聚焦顯微鏡顯示:FITC納米顆粒大都分布于細(xì)胞質(zhì)中,呈顆粒狀綠色熒光。4.載體材料PLGA對(duì)EPC活性的影響隨著空白PLGA納米顆粒濃度的增加,細(xì)胞的OD值較對(duì)照組均無明顯變化(P=0.495),提示PLGA材料與內(nèi)皮祖細(xì)胞生物相容性良好。5.匹伐他汀納米顆粒對(duì)EPC生物學(xué)功能的影響5.1對(duì)增殖功能影響:CCK8法分析顯示匹伐他汀納米顆�？纱龠M(jìn)EPC增殖(0.001μM匹伐他汀納米顆粒vs對(duì)照組,1.52±0.04 vs 1.41±0.02,P(27)0.05;0.01μM匹伐他汀納米顆粒vs對(duì)照組1.64±0.06 vs 1.41±0.02,P(27)0.01;0.1μM匹伐他汀納米顆粒vs對(duì)照組,1.86±0.05 vs 1.41±0.02,P(27)0.01)。與匹伐他汀原藥相比,在0.01μM、0.lμM濃度水平,匹伐他汀納米顆粒組促增殖作用顯著(0.01μM匹伐他汀納米顆粒vs0.01μM匹伐他汀,1.64±0.06 vs 1.53±0.06,P(27)0.05;0.lμM匹伐他汀納米顆粒vs 0.1μM匹伐他汀,1.86±0.05 vs 1.73±0.06,P(27)0.01)(n=9)。5.2對(duì)遷移功能影響:隨著匹伐他汀納米顆粒濃度升高,EPC遷移細(xì)胞數(shù)增加(0.01μM匹伐他汀納米顆粒vs對(duì)照組,89.28±4.25 vs 77.44±7.42,P(27)0.05;0.1μM匹伐他汀納米顆粒vs對(duì)照組,108.22±5.85 vs 77.44±7.42,P(27)0.01)。在0.lμM濃度水平,匹伐他汀納米顆粒組EPC遷移數(shù)高于同濃度匹伐他汀原藥組(0.lμM匹伐他汀納米顆粒vs 0.1μM匹伐他汀,108.22±5.85 vs 94.00±5.86,P(27)0.01)(n=18)。5.3對(duì)黏附功能影響:隨著匹伐他汀納米顆粒濃度升高,EPC貼壁細(xì)胞數(shù)增加(0.001μM匹伐他汀納米顆粒vs對(duì)照組,37.00±3.06 vs 30.72±4.17,P(27)0.05;0.01μM匹伐他汀納米顆粒vs對(duì)照組,43.06±2.01 vs 30.72±4.17,P(27)0.01;0.1μM匹伐他汀納米顆粒vs對(duì)照組,50.28±3.08 vs 30.72±4.17,P(27)0.01)。在0.01μM、0.lμM濃度水平,匹伐他汀納米顆粒組EPC貼壁細(xì)胞數(shù)均高于同濃度匹伐他汀原藥組(0.01μM匹伐他汀納米顆粒vs 0.01μM匹伐他汀,43.06±2.01 vs 38.28±4.03,P(27)0.05;0.lμM匹伐他汀納米顆粒vs 0.1μM匹伐他汀,50.28±3.08 vs 44.33±0.93,P(27)0.05)(n=18)。5.4對(duì)凋亡功能影響:流式細(xì)胞分析提示匹伐他汀納米顆粒可抑制EPC凋亡(0.001μM匹伐他汀納米顆粒vs對(duì)照組,14.07±2.69%vs 20.31±2.09%,P(27)0.01;0.01μM匹伐他汀納米顆粒vs對(duì)照組,10.37±2.04%vs 20.31±2.09%,P(27)0.01;0.1μM匹伐他汀納米顆粒vs對(duì)照組,3.28±1.34%vs 20.31±2.09%,P(27)0.01)。在0.lμM濃度水平,匹伐他汀納米顆粒抑制EPC凋亡作用優(yōu)于匹伐他汀原藥組(0.lμM匹伐他汀納米顆粒vs 0.1μM匹伐他汀,3.28±1.34%vs 8.54±2.64%,P(27)0.01)(n=3)。6.PI3K/Akt信號(hào)通路在匹伐他汀納米顆粒介導(dǎo)EPC增殖中的作用CCK8分析顯示匹伐他汀納米顆粒可促進(jìn)EPC增殖(0.lμM匹伐他汀納米顆粒vs空白納米對(duì)照組,1.99±0.10 vs 1.43±0.06,P(27)0.01)(n=9),同時(shí)Western blot結(jié)果提示匹伐他汀納米顆粒顯著促進(jìn)EPC Akt(Ser473)蛋白磷酸化(0.1μM匹伐他汀納米顆粒vs對(duì)照組,0.85±0.13 vs 0.55±0.14,P(27)0.01;0.1μM匹伐他汀納米顆粒vs 0.1μM匹伐他汀原藥,0.85±0.13 vs 0.70±0.17,P(27)0.05)(n=4)。而給予PI3K抑制劑處理后,匹伐他汀納米顆粒促增殖作用受到顯著抑制(0.lμM匹伐他汀納米顆粒vs 0.1μM匹伐他汀納米顆粒+LY294002(10μM),1.99±0.10 vs 1.57±0.09,P(27)0.01)(n=9),同時(shí)Akt(Ser473)蛋白磷酸化水平減弱(0.1μM匹伐他汀納米顆粒vs 0.1μM匹伐他汀納米顆粒+LY294002(10μM),0.85±0.13 vs 0.66±0.15,P(27)0.01)(n=4)。7.匹伐他汀納米顆粒干預(yù)后EPC修復(fù)損傷血管的研究7.1對(duì)EPC歸巢的影響:EPC移植后3天,熒光顯微鏡下觀察:損傷部位可見預(yù)先標(biāo)記的EPC聚集,同時(shí)FITC-UEA-I熒光染色陽性。且匹伐他汀納米顆粒處理后歸巢EPC數(shù)多于匹伐他汀原藥組(匹伐他汀納米顆粒干預(yù)EPC移植組vs匹伐他汀原藥干預(yù)EPC移植組,16.67±4.47 vs 12.33±1.53,p0.05)(n=3)。7.2對(duì)損傷血管再內(nèi)皮化的影響:伊文氏蘭染色法評(píng)價(jià)再內(nèi)皮化,結(jié)果顯示:EPC移植可促進(jìn)損傷血管再內(nèi)皮化,且以匹伐他汀納米顆粒組效果顯著(匹伐他汀納米顆粒干預(yù)EPC移植組vs匹伐他汀原藥干預(yù)EPC移植組,0.48±0.05 vs 0.41±0.02,p0.05)(n=3)。7.3對(duì)損傷血管內(nèi)膜增生的影響:HE染色后軟件分析內(nèi)膜與中膜面積比,結(jié)果顯示:EPC移植可抑制內(nèi)膜增生,且以匹伐他汀納米顆粒組效果顯著(匹伐他汀納米顆粒干預(yù)EPC移植組vs匹伐他汀原藥干預(yù)EPC移植組,0.79±0.23 vs 1.02±0.14,p0.05)(n=6)。結(jié)論1.超聲乳化溶劑揮發(fā)法可制備匹伐他汀納米顆粒,具備合適的粒徑大小和粒徑分布,模擬生理?xiàng)l件下具有緩釋效能;2.乳化法制備的納米顆�？杀淮笫笃⒃葱訣PC吞噬攝取,且載體材料PLGA與EPC生物相容性良好;3.匹伐他汀納米顆�？纱龠M(jìn)EPC增殖、遷移、黏附,并抑制其凋亡,效果較匹伐他汀原藥顯著;4.PI3K/Akt信號(hào)通路參與匹伐他汀納米顆粒介導(dǎo)的EPC增殖;5.匹伐他汀納米顆粒可有效促進(jìn)移植EPC歸巢、損傷血管再內(nèi)皮化、抑制內(nèi)膜增生。
【關(guān)鍵詞】：匹伐他汀 納米顆粒 內(nèi)皮祖細(xì)胞 PI3K/Akt信號(hào)通路 再內(nèi)皮化 內(nèi)膜增生
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-15
• 前言15-17
• 第一部分 匹伐他汀納米顆粒的制備及其性質(zhì)表征研究17-24
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料17-18
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法18-19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果19-21
• 1.4 討論21-23
• 1.5 小結(jié)23-24
• 第二部分 匹伐他汀納米顆粒對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能影響及相關(guān)機(jī)制研究24-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法26-30
• 2.3 結(jié)果30-37
• 2.4 討論37-39
• 2.5 小結(jié)39-40
• 第三部分 匹伐他汀納米顆粒修復(fù)損傷血管研究40-50
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料40-41
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法41-43
• 3.3 結(jié)果43-48
• 3.4 討論48-49
• 3.5 小結(jié)49-50
• 全文結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 文獻(xiàn)綜述 基于納米技術(shù)的干細(xì)胞療法在心血管疾病中的應(yīng)用進(jìn)展57-63
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 研究生期間發(fā)表論文63-64
• 致謝64

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2 孫燕,夏春林,何炎,施嬋宏,萬明輝;體外培養(yǎng)獲取高純度O-2A祖細(xì)胞[J];解剖學(xué)研究;2002年04期

3 袁紅豐;內(nèi)皮祖細(xì)胞研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊(cè);2002年06期

4 楊申淼,劉開彥,陸道培;外周血造血干/祖細(xì)胞動(dòng)員與采集時(shí)動(dòng)態(tài)快速監(jiān)測(cè)造血祖細(xì)胞的意義[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2003年03期

5 孫燕,王R，

本文編號(hào)：837087